内源性绵羊肺腺env基因的克隆和原核表达.pdfVIP

摘 要 研究背景：内源性绵羊肺腺瘤病毒(endogenous jaagsiekte sheep retrovirus ,enJSRV) 序列与外源性绵羊肺腺瘤病毒序列密切相关。在绵羊肺腺瘤病的发病过程中，虽然 enJSRV不对OPC的发生有直接地致瘤作用，但是在正常羊的个体发育过程中，enJSRV 的表达可能会对exJSRV 的感染和OPA （Ovine pulmonary adenomatosis）疾病的发生有影 响。 实验目的：克隆内源性绵羊肺腺瘤病毒的env基因，将内源性env基因重组进入原 核表达体系中，尝试诱导内源性env基因进行原核表达。为制备内源性env基因多克隆 抗体奠定基础。 研究方法：参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与3’长末端重 复序列保守区序列设计引物，以正常地绵羊肺脏基因组为模板，应用PCR技术扩增内 源性绵羊肺腺瘤env基因与3’长末端重复序列；将克隆的内源性env基因通过相应的酶 切位点，亚克隆到原核表达载体pET-32a 中，再转化入大肠杆菌BL21 中后用IPTG诱导 表达。通过SDS分析内源性env基因编码的蛋白表达并应用Western-Blotting鉴 定。用镍柱纯化内源性env基因编码表达的蛋白并应用Western Bloting鉴定。 实验结果表明：利用PCR成功扩增内源性env基因与3’长末端重复序列，测序得目 的片段长度为2249bp ，与预期片段长度一致；内源性env基因在原核表达体系中可以 少量表达，其原核表达蛋白的表观分子量为89kDa；对内源性env基因编码表达的蛋白 质经Western-Blotting鉴定，实验成功表达内源性env基因编码的蛋白；用镍柱纯化内 源性env基因编码表达的蛋白，通过Western Bloting鉴定表明纯化结果仅有一条带。 综上所述，在我国，此次实验首次克隆了内源性env基因，并将内源性和外源性 env基因进行比较。尝试表达内源性env基因编码的蛋白质，为进一步研究env基因在 绵羊肺腺瘤疾病的感染，疾病发生、发展中，以及内源性env基因在正常动物体内的 生理功能与所起作用奠定小小的基础。 关键词： 内源性绵羊肺腺瘤；内源性env基因；克隆；原核表达 Cloning and Prokaryotic Expression of Endogenous Jaagsiekte Sheep Retrovirus Env Gene Abstract The sequence of enJSRV and exJSRV has closely relationship. In the disease process of OPA though enJSRV does not have directly action in tumorigenic effects, in the individual development process of normal sheeps, the expression of enJSRV maybe affect the infection of exJSRV and the disease process of OPA. Our test is to clone endogenous env gene of enJSRV, and then restructure the endogenous env gene into the system of prokaryotic expression. Try to induce prokaryotic expression of endogenous env gene. Settle basis for making polyclonal antibody of endogenous env gene. To design the primer according to the conservative subsequence of env gene and long terminal repeat(LTR) which are published in