猪霍乱沙门氏菌78-1株δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究.pdfVIP

摘要 论文题目：猪霍乱沙门氏菌C78-1 株∆crp 缺失株的构建及其 生物学特性初步研究 专 业：基础兽医学 研 究 生：郁 川 指导教师：程相朝教授 摘 要 猪霍乱沙门氏菌( Salmonella Choleraesuis )是引起仔猪副伤寒的主要病原之 一，可引起断奶仔猪大批发病, 常因伴发或继发感染其它疾病或治疗不及时而大 批死亡，给养猪业造成重大损失。动物生前感染或食品受到污染, 可使人发生食 物中毒，在公共卫生上也具有十分重要意义。疫苗接种是防控仔猪副伤寒的最适 宜策略。在我国，研制仔猪副伤寒活疫苗比较成功的是有关专家将抗原性良好的 猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1 接种含有醋酸铊的培养基中传数百代后，选出了免 疫原性良好的弱毒株 C500 。但该菌株是经化学方法传代致弱，对其致弱的遗传 背景和引起免疫保护的机理目前仍不清楚。另外，该疫苗菌株具有一定的残余毒 力，且存在毒力返强的风险。 本研究旨在研制更加安全有效的猪霍乱沙门氏菌疫苗弱毒株，并为进一步 将其开发为适于粘膜免疫的口服疫苗活载体奠定一定基础，以 crp （cAMP receptor protein ，crp ）基因作为猪霍乱沙门氏菌C78-1 株减毒基因，运用重组自 杀性质粒介导细菌的等位交换技术两步法筛选猪霍乱沙门氏菌 C78-1 株 crp 基 因工程缺失突变株，并对其生物学特性进行了初步研究。主要内容包括： 1．crp 基因的克隆与序列分析 参照鼠伤寒沙门氏菌LT2 株(GenBank No ：AE008859)crp 基因序列，从猪霍 乱沙门氏菌C78-1 基因组中扩增出crp 基因。通过测序和序列对比分析显示，与 C500 株 crp 基因全序列完全相同，与 Genbank 上登录的其它全序列已知的 3 株 沙门氏菌crp 基因高度保守。 2 ．重组自杀性质粒pRE∆crp 的构建 以猪霍乱沙门氏菌C78-1 基因组为模板，分别扩增crp 上下游片段并将其克 隆入自杀性质粒pRE112 上，转化大肠杆菌χ7213 ，构建含缺失320bp 的crp 基 因重组自杀性质粒pRE∆crp 。 3 ．接合转移与缺失菌株∆crpC78-1 的筛选鉴定 I 摘要 以转化了重组自杀性质粒pRE∆crp 的大肠杆菌χ7213 为供体菌，C78-1 为受 体菌进行接合转移。利用重组自杀性质粒介导细菌基因等位交换技术两步法筛选 crp 基因缺失突变株，并进行PCR 和测序鉴定，以确定缺失菌株∆crpC78-1 的构 建成功。 4 ．缺失菌株∆crpC78-1 生物学特性研究 对缺失菌株 ∆crpC78-1 表型、遗传稳定性、生长特性及对小鼠的毒力等生 物学特性进行了鉴定，结果发现：缺失菌株∆crpC78-1 失去了利用麦芽糖、蔗 糖、果糖与甘露醇等碳源的能力，不能分解 H2 S ，但保留了利用葡萄糖的能 力；血清型与亲本菌株C78-1 一致，且能够稳定遗传缺失的crp 基因；小鼠致死 性试验结果表明其毒力较C78-1 降低约750 倍。 关 键 词：猪霍乱沙门氏菌；基因缺失；重组自杀性质粒；接合转移；缺失菌 株∆crpC78-1 论文类型：应用基础研究 II 摘要 Subject: Construction and Characterization of a Salmonella Choleraesuis C78-1 ∆crp deletion mutant Specialty: Basic Veterinary Medicine Name: Ch