绿脓杆菌atc27853菌株外毒素a全长编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达.pdfVIP

摘要 目的绿脓杆菌(Pseudomonas 染可发生在人体任何部位和组织，引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症；在幼小 畜禽中往往大群暴发，常与大肠杆菌混合感染，或者是出壳雏鸡接种马立克氏病疫苗 造成绿脓杆菌严重感染，1~2天内死亡达70％～80％。绿脓杆菌能产生多种与毒力有关 exotoxin 的物质，其中绿脓杆菌外毒素A(PseudomonasaeruginosaA，PEA)是一种致 死性外毒素，是绿脓杆菌最主要的致病因子。人们已经对PEA的结构与作用机制有一 定的研究，在此基础上，人们利用基因工程技术将它改造为具有医疗用途的蛋白质： 利用PEA的细胞毒性作用制成免疫毒素，作为治疗癌症的药物；利用PEA很好的免疫 原性制备防治绿脓杆菌感染的基因工程疫苗或将PEA作为蛋白疫苗佐剂和疫苗载体， 可以大大提高免疫原性；利用PEA能够携带蛋白质或DNA进入细胞中的特殊功能，将 其应用于基因治疗。PEA的上述重要的临床应用一直刺激着对PEA的分子结构和功能 个(K01397，strain PA01；CP000438，strain PAl03：AE004091，strain UCBPP．PAl4)， Blast分析结果显示它们的PEA碱基序列与氨基酸序列均存在着差异。研究不同菌株间 系，从而使PEA更好的应用于免疫毒素、疫苗方面和基因治疗。因此本实验拟克隆绿 研究。本实验也对克隆的PEA基因进行了序列分析，并构建其真核表达载体 核细胞中的分泌性表达，以便今后进一步研究PEA结构与细胞毒性和免疫原性的关 系，从而为PEA的细胞毒性和免疫原性在免疫毒素、疫苗和基因治疗方面的应用奠定 基础。 性引物，从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa exotoxin IU和劢口I双酶切鉴定和PEA基 pMDl8．T／PEA，经过蓝白斑筛选，限制性内切酶砌d 因内部的Kpn HI 和劢口I以及PEA基因内部的Apa 带有原信号肽(原核生物信号肽)的PEA基因能否在真核细胞中表达，本研究用真核 表达载体pcDNA3．1A／PEA转染人肾胚胎上皮细胞．HEK 空载体转染HEK293T细胞作为阴性对照。通过多次试验建立了磷酸钙方法瞬时转染 HEK293T细胞的真核细胞表达系统。用Westernblot方法检测PEA的表达。 泳鉴定，得到l条符合预期片段大小的特异性片段，即1914 bp。将PCR产物连接到 达载体，酶切重组质粒进行鉴定，电泳结果符合预期片段大小。结果证明 HEK293T细胞，Westernblot检测结果显示在分子量约为130KDa处有一条明显的杂交 带，而空载体在相应位置未见杂交带。 并将其转染真核细胞，实现了它在真核细胞中的分泌性表达，以便今后进一步研究 PEA结构与细胞毒性和免疫原性的关系，从而为PEA的细胞毒性和免疫原性在免疫毒 素、疫苗和基因治疗方面的应用奠定基础。 关键词：绿脓杆菌；PEA；克隆；序列分析；真核表达 ofExotoxinAGenefromPseudomonasATCC27853Strain Cloning Aeruginosa andits in Cells eukaryotic Expression Author．Wu Ling-juan