肉中单增李斯特和金黄色葡萄球菌双重实时pcr法的建立.pdfVIP

摘要 摘 要 食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因，对人类健康危害很大，其中单增李斯特菌 和金黄色葡萄球菌是两种常见的致病菌。单增李斯特菌可引起败血症、脑炎、脑膜炎、脓肿 及孕妇流产等一系列食源性李斯特菌病，病死率高达30％～70％。由于该菌在4。C冰箱保存 的食物中也可生长繁殖，故其危害性进一步增大。金黄色葡萄球菌是引起食源性葡萄球菌病 最常见种类，可引起呕吐、腹泻等临床症状。两种菌在自然界均广泛存在，人们食用的肉、 奶、蛋、水产品和蔬菜常受到这两种菌不同程度的污染，其中以肉和肉制品污染最为严重。 因此，建立肉中这两种致病菌的快速、可靠的检测方法具有重要的实际意义。荧光定量PCR 技术融汇了PCR的高效扩增、核酸探针杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确性定量的优 点。根据荧光定量PCR仪多通道的激发光源，可达到同时检测多种细菌的目的。目前为止还 未见运用荧光定量PCR技术同时检测肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的报道，故本试验 对肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR检测方法进行研究，以期能够快 速、准确的检测肉中这两种致病菌，从而达到预防和控制由这两种菌引起的疾病的目的。 以单增李斯特菌hty,4基因和金黄色葡萄球菌rluc基因为靶基因，分别设计一对引物和一 条TaqMan探针，在构建阳性重组质粒的基础上，分别建立基于TaqMan探针的检测单增李 斯特菌和金黄色葡萄球菌的单一荧光定量PCR方法，并分析其特异性、敏感性和重复性。特 异性结果显示，对于单增李斯特菌荧光定量PCR方法，10株单增李斯特菌均产生S型扩增 曲线，其它6株非单增李斯特菌均不产生扩增曲线；对于金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方 法，5株金黄色葡萄球菌均产生s型扩增曲线，其它6株非金黄色葡萄球菌均不产生扩增曲 线。敏感性结果显示，建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的标准曲线相关系数分别为 显示，建立的单增李斯特茵荧光定量PCR方法和金黄色葡萄球菌荧光定量PCR方法组内变 异系数均小于1％，组间变异系数均小于2％。 在单一荧光定量PCR方法的基础上，建立单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定 量PCR方法，分析两者的交叉反应，并制作标准曲线分析方法的敏感性。结果表明，单增李 斯特菌和金黄色葡萄球菌两者在建立的双重荧光定量PCR方法中互不影响各自的扩增效率， 两条标准曲线相关系数均在0．99以上，该法检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的敏感性分 另0为19．5拷贝／laL年Ⅱ18．7拷贝／uL。 将建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR方法应用到人工模拟肉样 的检测，确定这两种致病菌在人工模拟肉样中的最低检测限，建立肉中单增李斯特菌和金黄 色葡萄球菌的双重荧光定量PCR检测方法。结果表明，建立的肉中这两种致病菌的双重荧光 包括基因组提取在内的整个检测过程只需约3个小时，建立的方法可用于肉中单增李斯特菌 和金黄色葡萄球菌的同步、快速、定量、准确、敏感检测。 采用建立的肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法对哈尔滨100 东北农业大学农学硕士学位论文 份市售生肉样品进行单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测，并与传统培养法进行比较。结 果表明，荧光定量PCR法对单增李斯特菌的检出率为7％，对金黄色葡萄球菌的检出率为6％， 高于传统培养法对单增李斯特菌3％的检出率和对金黄色葡萄球菌3％的检出率。 关键词单增李斯特菌：金黄色葡萄球菌；肉；双重实时PCR Abstract Establishmentof Real—time PCR Duplex fo．r Detectionof Listeria and monocytogenes co ccusallrelISinMeat