国内禽戊型肝炎毒的分离鉴定及其抗原性的研究.pdf

山东农业大学博士学位论 中文摘要 禽戊型肝炎病毒 （Hepatitis E virus ，HEV ）是鸡的大肝大脾 （Big liver and spleen disease，BLS ）病或肝炎脾大 （Hepatitis-Splenomegaly，HS ）综合症的主要病原，主要 引起 30-72 周龄的蛋鸡和肉种鸡的死淘率升高和产蛋率下降（20-40% ），发病鸡通常腹 部充血，卵巢退化，肝脏脂肪或淀粉样变性，偶有肝脾肿大。该病曾给澳大利亚的养禽 业造成了严重的经济损失，而我国也时有该病爆发的报道。 禽HEV 与人、猪HEV 属于肝炎病毒属，为无囊膜，单股正链RNA 病毒，其基 因组全长约为6.6kb，比哺乳动物HEV 基因组全长少600bp 左右，包含5 帽子和3 PolyA 结构，含有3 个开放阅读框（Open reading frame ，ORF ），分别为ORF1 、ORF2 和ORF3 。 其中ORF2 基因编码衣壳蛋白是病毒的主要结构蛋白，并 包含病毒主要的抗原表位。 由于禽HEV 没有合适有效的体外培养系统，因此对该病毒的研究大多主要集中在病毒 的亚单位蛋白ORF2 上，通过原核或真核表达该蛋白，了解该蛋白的生物学活性和抗原 性等，从而为该病毒的诊断和预防等提供材料和理论支持。 1. 国内禽HEV 的RT-PCR 检测 根据实验室前期的禽HEV 的血清学调查结果，我们从山东部分的禽HEV 抗体阳性 率较高的鸡场，收集患有BLS 病或HS 综合症病鸡的粪便、胆汁和血清。然后参考国外 研究学者设计的禽HEV 检测引物，对收集样品中的禽HEV RNA 进行RT-PCR 检测。 结果从山东某肉种鸡场收集的粪便和胆汁样品中检测到禽HEV ORF2 部分序列，通过该 段序列与国外参考序列的 源性比较发现，与欧洲部分国家的分离株 源性较高。 2. 国内禽HEV 离株的全基因组序列分析 参考GenBank 上已知禽HEV 的全基因组序列，设计12 对引物。利用RT-nest-PCR 方法从禽HEV 核酸检测阳性的胆汁中，扩增六段相互重叠的禽HEV 的基因组片段，然 后通过软件拼接获得首个国内禽 HEV 分离株的全基因组序列，命名为 CaHEV 。将 CaHEV 与已知参考的4 个禽 HEV 全基因组序列进行 源性和进化树分析，结果发现 CaHEV 与欧洲 源性最高， 属于禽HEV 基因3 型。并 不 禽HEV 基因型的ORF2 之间，氨基酸 源性达到97% 以上，提示禽HEV 可能仅存在单一的血清型。 3. CaHEV 的致病性研究 将含有禽HEV 的胆汁翅静脉攻毒 1 周龄的SPF 鸡，对病毒进行增殖，然后用GE 方法对病毒悬液进行定量。利用定量的CaHEV 病毒悬液，通过口腔和翅静脉两种途径 1 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 山东农业大学博士学位论 分别攻毒15 周龄的SPF 鸡，每组26 只。攻毒后每天收集粪样，每三天收集血清，每周 剖杀两只鸡，直到第 12 周剖杀所有鸡只，收集剖杀鸡只的胆汁，肝脏和脾脏 时观察 剖杀鸡只的肝脏和脾脏的肉眼损害以及其病理学变化。通过对收集样品的RT-PCR 检测 发现，翅静脉攻毒组，攻毒后第 3 天就能从粪便中检测到病毒，一直持续到攻毒后 54 天仍能检测到；第6 天开始出现病毒血症，约持续到第21 天左右；口腔攻毒组，在攻 毒后第6 天开始粪便排毒，第62 天仍然排毒，病毒血症开始出现在第12 天，持续到第 33