猪传染性胃肠炎毒单克隆抗体的制备与鉴定.pdf

摘 要 Gastroenieritisof 猪传染性胃肠炎(Transmissible swine，TGE)是一 种以仔猪出现严重腹泻、呕吐和脱水为特征的高度接触性肠道传染病，其 of VirusSwine， 病原为猪传染性胃肠炎病毒(TransmissibleGastroenteritis TGEV)。临床上TGEV与同种属的其他腹泻病毒难于区分，致使对该病 的诊断和预防带来了很大困难。由于单克隆抗体对抗原的识别具有特异 性，因此在疫病病原的诊断中优势突出。而单克隆抗体识别的抗原表位， 有助于了解TGEV抗原结构与功能的关系，对该病的诊断具有重要意 义。本研究首先用差速离心的方法纯化TGEV，以纯化病毒为免疫抗原， 经皮下多点注射免疫BABL／c小鼠，三次免疫后进行细胞融合，利用 TGEV感染的PKl5细胞进行间接免疫荧光检测，筛选阳性杂交瘤细胞 株，并利用有限稀释法克隆阳性细胞株，对经三轮以上筛选为阳性的细胞 株进行扩大培养和低温冻存，同时利用BABUc小鼠制备腹水迸～步验 证，试验结果表明我们获得了一株能稳定分泌抗TGEV抗体的杂交瘪细 了进一步确定单抗4E2所识别的病毒蛋白，我们克隆获得了TGEV的N 基因，同时将N基因分成N1和N2，分别将其亚克隆至原核表达载体 pGEX6p．1、pET一30a中，获得重组表达载体pGEX6p—N、pET-30a—N1，并 分别在大肠杆菌中进行了表达，利用TGEV阳性鼠血清对表达产物进行 Western blot分析，证实表达的两个融合蛋白都具有较好的反应活性。然 后分别以表达的融合蛋白为抗原，对获得的单抗4E2进行间接ELISA和 Western N蛋白以及 blot检测，结果显示单抗4E2可以特异性识别TGEV N蛋白，而且其 N1蛋白，进一步证实我们获得的单抗4E2是针对TGEV 所识别的抗原表位位于N蛋白N端192个氨基酸，本研究结果为今后临 床中对TGEV的可靠性诊断提供了有效工具。 为弄清近年在上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因，我们随机采集发 病猪场的仔猪腹泻样品9份，利用RT—PCR方法对采集样品进行病原检 样品的VP6和VP7基凶进行RT．PCR扩增、基因克隆和序列测定分析， 结果显示，4份阳性样品的VP6基因大小为1 356bp，VP7基因大小为 l100bp，根据结果分析，我们确．定此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由 属于A群G9血清型的PoRV引起，本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提 供了依据。 关键词：猪传染性胃肠炎病毒；单克隆抗体；抗原表位；猪轮状病毒；序 列分析 GenerationandIdentincationofMonoclonalAntibodies of ofSwine TransmissibleGastroenteritisVirus Against Abstract Transmissible swineisakindof Gastroenieritis(TGE)ofcontagious disease of loss，anorexia， pigs，causingwaterydiarrhea，vomiting，weight which isswine Transmissib