禽致病性大肠杆耐药基因和毒力因子的分子流行病学及hpi irp1细胞表位作用的研究.pdf

禽致病性大肠杆菌耐药基因和毒力因子的分子流行病 学及HPI Irpl细胞表位作用的研究 研究生：金文杰 指导教师：秦爱建教授 摘 要 一、禽致病性大肠杆菌的分离鉴定及血清型分析 从江苏等5省不同地区送检的临床发病家禽，剖检可见肝周炎、心包炎、气 囊炎、输卵管炎及卵黄性腹膜炎等病变，采集病料分离获得近500株细菌。经糖 发酵试验、尿素酶试验、IMⅥC试验等生化试验以及三糖铁培养基培养试验，证 实所获得的366株细菌为大肠杆菌。用大肠杆菌多因子血清和单因子血清进行血 清型鉴定，对其中296株测出了血清型，覆盖了56种血清型，其中078，088， 变得日益复杂，在种类增加的基础上，与地区、宿主等亦有很大相关性：(1)不 同地区来源的菌株优势血清型不同，南通分离株优势血清型为078，024，011， 09。(2)不同家禽来源的菌株，血清型分布有较大差异，鸡、鸭、鹅源菌株血清 明，不同血清型菌株可能存在宿主特异性。 二、禽致病性大肠杆菌分离株耐药性检测 为了了解临床用药对细菌耐药性的影响，对346株禽致病性大肠杆菌分离菌 株用圆纸片法进行了针对氨苄西林／舒巴坦、头孢噻肟、头孢曲松、庆大霉素、阿 米卡星、链霉素、四环素、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、复方新诺明、氯霉 素、磷霉素、新霉素、利福平、痢特灵、壮观霉素、多黏菌B、阿奇霉素等19种 抗生素的药物敏感性测定，对药敏试验结果进行统计、分析，结果表明在所选的 19种抗生素中，禽致病性大肠杆菌对常用抗生素的耐药性已十分严重，在测试的 药物中，一些较早使用的抗菌素氨基糖苷类药物如链霉素、庆大霉素，磺胺类药 物如复方新诺明等，对大部分禽致病性大肠杆菌分离株已基本失去抗菌作用，链 霉素、环丙沙星等多种药物的耐药菌株数(耐药率)己超过50％；但APEC分离 株对如头孢噻肟、头孢曲松，以及磷霉素类药物等均较为敏感。APEC分离株普遍 存在多重耐药现象，只对1种药物有耐药性的菌株只有1株，能耐8种以上受试 药物的菌株有309株，占总受试菌株的89．3％，部分菌株甚至对16种药物产生了 耐药性。对优势血清型菌株耐药情况迸行统计分析，结果表明血清型与耐药性表 型之间没有明显相关性。实验结果提示我们，在禽大肠杆菌病乃至其他细菌病的 防治中要合理使用抗菌药物，尽量减小耐药性带来的负面影响。 三、耐药基因的序列分析及其在禽致病性大肠杆菌中的分子流行病学 研究 为了了解日益严重的APEC耐药性产生的机制，本研究对耐氨基糖苷类药物 o、j、OXG一』， 序列设计引物结果从细菌基因组中扩增出aadAl、strA、strB、aph 肠杆菌进行药物抗性基因的分子流行病学检测，结果发现aadAl、oxa一5阳性率分 多数菌株携带有多种耐药基因，一个菌株同时携带2种以上耐药基因的有167株， 占到了全部测试菌株的77．3％；最多的携带了7种被检测的耐药基因；大多数携带 了3至5种耐药基因，耐药基因检测全阴性的只有20株，占全部被检菌株不到10％。 综合耐药基因检测结果和耐药性检测结果分析发现，耐药基因检出率的高低基本 与相关药物的耐药率呈正相关。这为我们了解耐药性产生的机制以及进一步进行 更大范围的耐药基因的分子流行病学研究奠定了基础。 四、菌毛基I困fimC和papC在禽致病性大肠杆菌中的流行病学研究 菌毛是细菌的一种重要黏附因子，fimC和papC是大肠杆菌I型菌毛和P菌毛 11 结果显示93．5％的分离菌株携带有fimC，表明I型菌毛在禽致病性大肠杆菌中广 泛存在，而papC仅有14株检测阳性，占6．5％，其中有13株与I型菌毛同时存 在。结果提示我们，对于APEC来说，I型菌毛是其重要而且普遍存在的致病因 子，而P菌毛在其致病作用中可能起到了辅助加强作用，两者同时存在于同一菌 株中对毒力的影响尚须进一步实验验证。 五、耶尔森菌毒力岛HPI irp2和痧州基因在禽致病性大肠杆菌中的流 行病学研究 因片段进行克隆和序列测定，测序结果与GenBarlk参考序列比较，同源性高达98％ 以上。用建立的PCR方法对本室分离鉴定保存的216株禽致