大肠杆菌、乳酸菌“活的非可培养状态”研究.pdfVIP

大肠杆菌、乳酸杆菌“活的非可培养状态”研究 摘 要 细菌“活的非可培养状态”自20世纪80年代发现至今，一直是预防医学、流行病 学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一。因为进入VBNC 状态的病原菌在不良环境中，不但丧失了在培养基上生长繁殖的能力，而且具有与原菌 相似的致病性，成为可以逃避检测的“隐性”传染源，对周围的环境及人类安全构成潜 在威胁。目前，国内外对VBNC研究多集中上述领域，可以范围相对狭窄，所涉及的细 菌种类也有限，仅局限于自然环境中的致病菌，并以G一菌居多。现在已确知，至少有 40多种细菌存在vBNC状态，但尚未见到“益生菌”存在VBNC状态的报道。为了补 充、扩大具有VBNC状态的细菌种类与数量，本研究以不同来源的乳酸杆菌和大肠杆菌 作为研究对象，首先筛选确定了诱导VBNC状态的因素；其次利用平板计数、吖啶橙和 观察；再次对VBNC细菌进行了复苏实验；最后又对正常与VBNC状态乳酸杆菌的主 要生物学特性进行了比较。 研究结果表明： l、大肠杆菌El和E2在含有2％冰醋酸的LB培养基中，于4℃需氧培养，可分别在12 天和22天后进入VBNC状态，并分别于72天和60天后丧失该状态。 丧失Ⅵ悄C状态，而R2在100天后仍能维持该状态。 需时间均不相同，而时间长短与原菌自身生理特性及对外界环境抵抗能力成正相关。 4、Twecn-80可将处于VBNC状态的大肠杆菌和乳酸杆菌恢复为可培养状态，实现复苏。 一般地，刚进入VBNC状态的细菌易被复苏，但已经由VBNC状态转入真正死亡状 态的细菌复苏能力丧失。 5、正常状态的乳酸杆菌R2不但对酸有较强的耐受性，而且还对0．2％的胆盐和1％的胃 蛋白酶有耐受性。相比之下，vBNC乳酸杆菌R2对强酸、1％胃蛋白酶都具有较强 耐受性，但对胆盐则不耐受。 除此之外，为了探讨细菌VBNC状态的发生机制，本研究根据大肠杆菌基因组中 杂交、序列测定及Blast检索等，共获得3个同源性较高的差异片段(A1，A2和C1)。 ii 研究结果表明： 态大肠杆菌表达基因，为差异基因。 的核苷酸同源性，其中cl最高，高达99％；AI和A2次之，但两者也均在98％以 上，说明所获序列为大肠杆菌基因。 态下的基因转录或核糖体大亚基的自身构成。 4、实验所获3个差异片段不仅与大肠杆菌23srRNA基因高度同源，而且还与志贺氏菌 属和沙门氏菌属中的细菌23srRNA基因高度同源，同源性均在92％以上，而同源性 的高低与种属亲缘关系远近密切相关，表明实验所获序列是一个比较保守的基因， 并且广泛存在于与大肠杆菌及其相近的种属之中。 5、正常大肠杆菌在未暴露任何压力下时，其转录水平较低，特别是23srRNA的某一(些) 基因不表达或表达量极低。当进入VBNC状态后，面临生存压力时，大肠杆菌转录 水平增加，而核糖体作为蛋白质合成的主要结构与场所，其某些基因将积极参与新 蛋白质的生合，由此推知实验所获3个基因可能参与VBNC状态的发生及相关新蛋 白的合成。 关键词： 细菌“活的非可培养”状态， 大肠杆菌， 乳酸杆菌， mRNA差异显示， 作用机制 Escherichiacoliand onviablebutnon-culturable Study lact／s LactobacHlus Abstract statebacterialhas fundamentalresearchissucsin vlablebutnon-culturablein cells becomethe medical microbialandsanitation sinceitwos microbiology,epidemiology,generalecology