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Western Blotting的问题与对策 Steven Product manager Apr 24 ,2007 3.Western Blotting的问题与对策 Western Blotting方法选择 检测系统比较 检测方法 影响Western blotting成功的要素 常见问题分析与对策 Western Blotting方法二: 间接法 优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化 检测方法 化学显色法: 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法: 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、 环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法： Krypton ?荧光底物 第一步：电泳分离蛋白质 蛋白抽提：材料，组分，量，降解 样品制备：盐，不相容物质 电泳：预制胶，上样缓冲液，转膜 养成使用内参的实验习惯 建议一：蛋白抽提 建议二：蛋白质定量：估计蛋白质丰度 BCA 准确灵敏：20－2000μg/ml； Micro BCA 0.5-20μg/ml（Pro#：23235） 变异系数远小于考玛斯亮蓝法 快速：45分钟,比经典的Lowry法快4倍 经济实用：试管或微孔板测定 与离子型和非离子型去污剂相容 与还原剂和金属离子等不相容： Commassie改良增强Kit 优点 1－2000ug灵敏度,125-1500ug/mL线性反应最好 一种试剂，简单，快速 相容性好：还原剂，盐和金属离子以及螯合剂 变异性小于普通考染法 Micro法(1-25ug/mL） 试剂冷冻保存2年 缺点 非线性颜色反应 去污剂干扰 变异系数大于BCA 建议三：样品制备:去除小分子，确保电泳成功 传统透析的瓶颈 特殊预处理，让你饱受煎熬 低回收率，让你暴跳如雷 难于操作，特别是处理小量样品难上加难 由于泄漏导致珍贵样品的丢失比比皆是 长时间透析让你欲罢不能 SnakeSkin?透析袋（15-100ml，无须预处理） Slide-A-Lyzer?微量透析管（ 10-100 ?l ） Slide-A-Lyzer?透析卡（0.1 - 0.5ml,0.5 to 3ml,ml to 12ml,12ml to 30ml） Microdialyzer 微量透析系统 建议四：样品制备：去除盐等不相容物质，确保电泳成功 脱盐 用于蛋白质缓冲液置换 去除核酸溶液中的酚 去除未连接成功的交联剂 标记蛋白时未标记的染料分子等 去除探针标记时的同位素 传统脱盐柱的所有瓶颈 烦琐的重力分部收集 受限的上样样品体积 样品回收率低 回收样品稀释 操作费时费力，无法同时多样品并行处理 新改良的脱盐方法： Zeba?离心式脱盐柱 截留范围 1000 ;样品7000 95%的盐和分子量小于1000的分子储留能力 易于使用，无需平衡和装柱，离心一步收集 无需多步多组分收集，样品几乎没有稀释 快速，少于6分钟 同时多样品并行处理 多种样品体积备选 Zeba?微量离心式脱盐柱： 2 – 12 μl 样品 Zeba?离心式脱盐柱： 30μl－4mL样品 Zeba?96孔离心式脱盐板： 5分钟内并行高通量脱盐， 20 – 100 μl 样品 建议五：样品制备:浓缩样品，增加上样量 Slide-A-Lyzer? 蛋白质浓缩液 原理：亲水的高分子聚合物，将样品中的水和小分子抽吸出来，达到浓缩目的 特点： 精制的高分子聚合物，去除了小分子物质，避免了污染 80分钟内浓缩5－10倍 与透析卡配合使用，效果更佳 Pro#:66530; 66528; 66529 传统浓缩的瓶颈 堵塞离心柱 低回收率 浓缩效果差 长时间倒置离心 iCON?蛋白质浓缩管 30分钟内取得150-400倍的浓缩效果 样品收集简单，且无需倒置离心 大于90%的样品回收率 9K和20K两种截留选择 样品范围从1-7毫升和5-20毫升 适用于平转头和角转头 Pro#:89884-89887 建议六：样品制备：净化与富集同步，确保条带清晰漂亮 PAGEprep?蛋白质净化与富集Kit（Pro：89888） 原理 在DMSO存在下，蛋白质与修饰过的硅藻土胶结合，原缓冲液被离心洗去，上样缓冲液离心洗脱蛋白 特点： 无需透析即可高效去除染料、还原剂，去污剂、糖、甘油、尿素、硫酸铵和胍等与PAGE电泳不相容的杂质 处理小至1ul样品 10分钟内完成,可直接上样电泳