玉米弯孢霉叶斑菌突变株致病相关性状分析与基因克隆.pdf

  Dissertation submitted for requirement of Master’s degree MUTANT PATHOGENICITY CHARACTERISTIC ANALYSIS AND RELATED GENE CLONING IN CURVULARIA LUNATA IN MAIZE Graduate Xue Jiang Supervisor Prof. Jie Chen Major Plant Pathology Shanghai Jiao Tong University Shanghai, China January, 2010   本研究承蒙 国家科技支撑计划项目(2006BAD08A06) 国家自然科学基金项目 资助   玉米弯孢霉叶斑病菌突变株致病相关性状分析与基因克隆 摘 要 玉米弯孢霉叶斑病是由新月弯孢霉（ Curvularia lunata (Wakker)Boed ）引起的一种重要玉米病害。尽管近年来由于抗性品种 推广，病害得到一定控制，但由于该病原菌存在明显生理分化现象， 且我国玉米种质资源遗传基础狭窄，抗性资源趋同化严重，该病害再 次爆发的风险性较大。目前关于该菌致病分子机理研究报道少且不深 入，这直接影响了对该病害有针对性的综合防治。为此本研究通过 ATMT （Agrobacterium-mediated transformation ）方法构建玉米弯孢霉 叶斑病菌突变株，分析突变株致病性相关生物学性状，克隆致病相关 基因。 1、通过农杆菌介导的基因转化技术(ATMT)，以野生强致病型菌 株 CX3 为出发菌，构建玉米弯孢霉叶斑病菌转化子。首先研究了弯 孢霉叶斑病菌分生孢子萌发时间、农杆菌菌株、共培养时间与温度对 转化效率的影响，从而优化了转化条件，使转化效率提升至 84±5 个 /106 个分生孢子，共获得 ATMT 突变株 1,454 个。 2 、从大量突变株中筛选到 9 个在菌落形态颜色、生长速度等性状 上有显著变化的突变株，分别测定其产孢量、细胞壁降解酶活性、毒 素、致病相关基因表达量等指标，并通过离体和活体接种确定突变株 致病性，获得弱致病性突变株 5 个，为研究致病相关基因提供了良好 I  材料。 3、通过 PCR 、Southern blot 确定突变株 CLM-1648 为 T-DNA 单 拷贝插入。利用 Genome Walking、RT-PCR 技术，并结合生物信息学， 克隆了 T-DNA 插入位点的基因。经过 BLAST 分析，该基因与小麦 黄斑叶枯病菌（Pyrenophora tritici-repentis ）ATP-phosphoribosyl transferase 基因序列有 78% 的相似性。该基因全长 1,175 bp，含有两 个内含子，cDNA 全长 1,038 bp，在弯孢霉叶斑病菌基因组中为单拷 贝。RT-PCR 分析表明 T-DNA 插入影响了该基因在菌体内的表达量。 推测该基因通过调控组氨酸代谢或其它致病相关生理过程影响病菌 的致病性。