松材线虫、相似孔线虫半胱氨酸蛋白酶基因的分离与特性分析.pdfVIP

摘要 酶。线虫的半胱氨酸蛋白酶大多表达在虫体的食道腺、肠细胞中，发挥其水解活性，是线虫的主 要“消化酶’’。半胱氨酸蛋白酶在线虫的入侵组织或细胞、提供胚胎发育所需要的营养成分、蜕 皮、消化宿主蛋白、免疫逃避等过程中发挥关键作用，与多种重要动植物疾病密切相关，是近年 来备受关注的一类靶标蚩白酶。已有大量报道证明半胱氨酸蛋白酶在动物寄生性线虫、自由生活 线虫的发育、免疫活性等方面都具有关键作用。而在植物固着性寄生线虫(如大豆胞囊线虫、根 结线虫)中的几例报道也预示了它的重要性，而在植物迁移性寄生线虫中至今未见对其的报道。 similis)中分离得到半胱氨酸蛋白酶基因全长及片段，并对松材线虫半胱 穿孔线虫(Radopholus 氨酸蛋白酶进行原核表达。本研究为进一步测定蛋白酶活性，更好的了解此蛋白酶的功能奠定了 理论基础，也为植物寄生性线虫的防治提供新的靶标和思路。主要研究结果如下： 1． 胱氨酸蛋白酶(cP)的氨基酸序列，利用DNAman软件进行同源比对分析并根据植物寄生 性线虫CP密码子偏好设计简并引物，通过RACE法获得植物迁移性寄生线虫：松材线虫、 相似穿孔线虫CP基因的eDNA全长并进行深入分析。本研究从松材线虫中得到两个L型半 胱氨酸蛋白酶基因，分别命名为Bx-CPLl、Bx-CPL2，其cDNA全长分别为1220bp、1161bp， 12 cDNA全长为1388 bp，登录号EU659125； bp，登录号EU659124；Rs—CPScDNA全长为11 同时从相似穿孔线虫中得到498bp的L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA片段。生物信息学软件 详细分析以上序列及构建系统发育树，结果证明这四个基因全长及一个cDNA片段均具有 CP家族的典型特征。 2． 成，获得了松材线虫CP基因结构上的基本信息。 3． blot、验证蛋白酶活性 所得的pET．28a．Bx．CPL2的原核表达为下一步提纯融合蛋白、Western 提供依据。 关键词：半胱氨酸蛋白酶，松材线虫，相似穿孔线虫，内含子，原核表达 Abstract tothe ofacore so—nameddue function catalyticcysteine，which Cysteineproteases(CP)are worm’s andintestineeels mediates in proteasesexpressed esophagusgland proteinhydrolysis．Cysteine indicated arethe nematodes．Previousstudies that enzymes”of cysteineproteasesplay main”digestive rolesintissueandcellular nutrient key invasion，moult，embryogenesisacquisition，hostprotein wellasimmunoevasion．Lotsofanimaland diseaseshavebeenshowntObe processing，as