柿树炭疽菌突变致病性及相关基因的克隆.pdfVIP

摘要 柿树炭疽病(Persimmon Penz．，在本文中也称柿树炭疽菌)侵染造成的，在全世界产柿国 gloeosporioides 家均有发生。柿树炭痘病最近几年在浙江严重发生，已成为影响柿树产业发展的 限制因素。为深入了解病原菌一寄主植物互作的机制，本试验室用农杆菌介导转 化柿树炭疽菌，获得了致病相关的突变体，并构建柿树炭疽菌基因组文库。在此 基础上，本文主要从突变体形态学、侵染寄主的细胞学方面进行研究，并进行致 病相关基因的克隆。 1柿树炭疽茵突变体形态学的研究 突变体的菌落和分生孢子形态特征与野生型对照进行了比较分析。 型对照相似，其余5个突变体变与对照相比，变化较大。此外，与对照相比，突． 变体菌株产孢量都较少，尤其是突变体Cg．10与Cg．522几乎观察不到菌落上有分 生孢子的存在。 分生孢子形态观察表明，突变体cg．32、Cg一522和Cg．573孢子形态变化最大， 生孢子形态与对照相似。差异显著性结果显示，所有突变体的分生孢子长度均与 对照有显著差异，而突变体的分生孢子宽度与对照相比差异不明显，只有突变体 著差异。其中，突变体Cg．522不论是分生孢子的长度还是分生孢子的宽度均与其 它菌株差异显著。 2致病性试验 接种无核柿新梢和叶柄的致病性试验显示，只有突变体cg．32无致病性，其 Cg．613在70小时后都出现病斑。但与野生型对照相比，突变体产生的病斑相对 较小。 3突变体侵染寄主的细胞学观察 接种98h后取样，切取寄主表皮组织，经脱色、染色后，在显微镜下观察 在侵入的寄主细胞内产生了初生菌丝或侵染泡囊，没有观察到次生菌丝形成；突 变体Cg．32、Cg．10、Cg．522和Cg·573从附着孢上产生了侵染钉，但没有侵染 泡囊的形成。野生型对照菌株TSG001中，不仅观察到有初生菌丝产生，也有次 生菌丝形成。 4 Southern杂交分析 菌突变体基因组DNA中均插入了T．DNA。Southern杂交结果表明，只有突变 体Cg．371杂交出现一条单拷贝带，其它4个突变体均无杂交条带出现。 5突变体侧翼序列的扩增 采用反向PCR的方法扩增突变体Cg．371的侧翼序列，获得了T-DNA插入位点 的左臂侧翼序列，其大小为364bp。将扩增序列递交至JJNCBI网站进彳亍BLAST搜索， grisea菌株70-15的 结果显示，Cg．371序列@47．257bp的21lbp序列Magnaporthe 00％。 hypotheticalprotein(MGG_01057)部分mRNA中部分序列同源性达到1 出了T-DNA插入位点的左臂侧翼序列，其大小为275bp。该序列经过BLAST搜索， 没有找到高度同源序列。 Abstract is and PersimmonanthracnosecausedColletotrichum Penz by gloeosporioides occurs in countries the allovertheworld．In widelymany cultivatingpersimmon recent anthracnosealsooccurred intheChunan years，Persimmon seriously area, andit alimitedforthe Zhej became factor of iangprovince developmentpersimmon