最新基因工程第八章克隆基因的表达.ppt

环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。 CAP的功能：显著提高酶与启动子结合常数：①CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向，以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。②CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。 温度控制诱导DNA复制的质粒pCI101 整合到染色体中 乙肝表面抗原 乙肝表面抗原 （2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达 作为饲料添加剂促进反刍动物消化。 产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。 乙醇氧化酶基因1 乙醇氧化酶基因1 二、昆虫培养细胞表达系统 1. 杆状病毒（Baculovirus） 广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。 （1）侵染周期： 两种形式 ①单独病毒粒子形式 病毒 粒子 宿主细胞 病毒 粒子 侵染 释放 病毒 粒子 宿主细胞 侵染 宿主细胞 侵染 合成多角体蛋白 裂解 释放 多面体溶解 一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV） ②多面体形式 （2）杆状病毒的表达特点 ①感染后36-48h，病毒开始合成大量的 多角蛋白。 ②多角蛋白的启动子特别强。 ③多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。 多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。 3. 转化子筛选 通过显微镜检查看是否有多面体形成。 源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。 2. 最普遍应用的宿主细胞株 （1）转移载体的构建 大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。 4. 杆状病毒转化载体 杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。 必须使用同源重组的办法。 多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。 启动子与终止子之间插入多克隆位点 转移载体 （2）杆状病毒载体转化过程 ① 转移载体中插入外源基因 ② 转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞 ③ 转移载体与病毒基因组发生双交换 ④ 外源基因被交换转入病毒基因组中 ⑤ 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。 4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白 组织型纤溶酶原激活剂 Simian rotavirus外壳蛋白抗原 狂犬病病毒糖蛋白 类狂犬病病毒蛋白 脊髓灰质炎病毒蛋白 鼠单克隆抗体 Lassa virus蛋白 白细胞介素2 流感病毒凝集素 HIV-1外壳蛋白 红细胞生成素 Blue tongue virus中和抗原 β淀粉酶前体蛋白 β干扰素 腺苷酸脱氢酶 α干扰素 外源蛋白 外源蛋白 人胰岛素分子 抗体分子 人血红蛋白分子 亚铁血红素 如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。 2. 前体切割 （1）O-糖基化（Ser, Thr） 3. 蛋白质糖基化 糖基 （2）N-糖基化（Asn） Dol：长醇 Mannose：甘露糖 Glucose：葡萄糖 N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖 甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化 4. 氨基酸残基的修饰 羟脯氨酸 甲基组氨酸 羟赖氨酸 羧基谷氨酸 缺乏蛋白质的加工。 （如糖基化、氨基酸修饰等）。 十、原核细胞表达的缺陷 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。 第二节 外源基因在真核细胞中的表达 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子 外源基因 ① 能在E.coli中克隆和扩增。 1. 酵母克隆载体 一、在酵母中表达 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; ④ 有合适的克隆位点。 ③ 有酵母的选择标记 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段（选择标记）构成。 ColE1 酵母Leu 2+ 如 PYeleu10: （1）整合型载体(YIp) ①转化率低（1~10转化子/微克DNA）。 特点： 载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。 可与受体细胞