幽门螺杆菌urb基因及其片段的表达和免疫研究.pdfVIP

幽门螺杆菌“厂e口基因及其片段的表达和免疫研究 摘要 幽门螺杆菌(月P妇D6以cfPr刀怕，i，Hp)是一科t革兰氏阴性菌、呈螺旋 形，足引起人发生慢性活动性胃炎、胃和十二指肠溃疡的主要病原菌， 同时与胃腺癌、胃粘膜柏关淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生也密切相 关。临床现有的根除Hp的手段主要是联合应用抗生素，但由于该菌 感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从 性等，限制了抗菌药物的疗效，因此，迫切需要进行免疫防治研究工 作。 幽门螺杆菌尿素酶是一种高亲和力、高活性和高分子质量的蛋白 质。纯化尿素酶是山尿素酶A亚单位和B亚单位组成。尿素酶具有 保护力、免疫原性、表面暴露和高度保守性，是幽门螺杆菌的主要抗 原成分，尤其是尿素酶B亚单位(ureB)，已经被证明可以刺激机体产 生免疫应答且具有较好的免疫保护性。但是，由于ureB分子较大， 在大肠杆菌中不易重组表达，而且ureB的重组表达产物多为包含体 形式，表达蛋白失去活性而且提取工艺复杂。凶此，我们以本实验室 构建的具有分泌表达系统的大肠杆菌基冈工程菌，即转入“，胡及其 P、厂、m三个不同片段的大肠杆菌为研究对象，分析不同重组蛋白 (rUreB、E、F、M)的表达和免疫性质。 l、借助生物信息学技术对重组蛋白理化性质、二级、三级结构 等进行预测、分析，为实验结果的分析提供依据 2、用sDS—PAGE分析重组蛋白的表达情况，实验结果表明“，却 基凶及其小片段在大肠杆菌巾均有特异性表达；用westem-blof检测 其抗原性，结果说明蘑组蛋白都具有一定抗原性；表达形式鉴定结果 为rureB主要存在于包含体中，F在包含体、周质和细胞质组分r}，都 仃一定的蛋白积累，而M和E主要存在于周质r{，；对表达条件进行 了优化，结果为在对数中期加酸调节PH为5．5、继续培养至12h时 表达量最高。 3、将基凼jI：程菌表达产物结合免疫佐剂皮下多点注射免疫 BALB／c小鼠，免疫四次，每次问隔7火，采集血清J1jELISA法检 测各组小鼠血清中19G和IgA水平，比较不同免疫原产生的免疫应答 情况。BALB／c小鼠经重组蛋白免疫后产生了具有显著性的免疫应答 (P0．01)，不同重组蛋白小鼠免疫组血清lgG水平强到弱依次为： 4、免疫实验结束后用幽门螺杆菌ssl对小鼠进行攻击，38天后 用快速尿素酶试验、涂片实验和Giemsa染色对H口在动物胃内的定 植及生长情况进行评价，用HE染色对Hp攻毒实验后小鼠胃组织的 病理情况进行评价，探讨重组蛋白对Hp感染的免疫保护作用。结果 表明小鼠经Hp攻毒实验后胃组织全部有HP定植，重组蛋白免疫组 都具有一定保护作用，刁i仅能使免疫小鼠Hp感染数目减少，而且能 减轻胃粘膜慢性炎症反应。rUreB、F、M、E的保护率依次为50％、 40％、70％、50％。 本研究结果说明：“舢及其不同片段可在本实验室构建的人肠 杆菌分泌表达系统中获得表达。m、g片段获得可溶性表达产物。重 组蛋[J免疫后可引起小鼠产生较强免疫应答。重组蛋白免疫组小鼠对 幽门螺杆菌攻击具有免疫保护作用，M免疫组保护作用最强。 关键刊：幽门螺杆菌，“r出，』I段，表达，免疫 IMn仉，NITY0F STUDIES0NEXPRESSIONAND HELICOBACTER ANDFRAGMENTS PYLoIU“re8GENEITS ABSTRACT the bacterium，is 月Pfic06以cf卵p少，0ri(Hp)，agram—negativespiral most ulcer factorofchronicactiVe and peptic majoretiological