免疫学实验——改摘要.pptVIP

白细胞介素35对肝癌小鼠T淋巴细胞的影响 第三组 研究背景 肿瘤已成为人类健康的头号杀手，肿瘤的治疗研究也是生物医学领域一个炙手可热的方向。 肿瘤抗原被机体免疫系统所识别，并由此激发特异性免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫。 适应性免疫效应细胞包括CD8+CTL、CD4+Th以及固有免疫细胞包括NK细胞、巨噬细胞、NKT细胞等参与了机体的抗肿瘤作用。 肿瘤的体液免疫主要是抗肿瘤抗体对肿瘤细胞的破坏效应。除此之外，免疫效应分子还有干扰素、肿瘤坏死因子。 研究现状 IL-35 IL-35是一种由调节性T细胞(Tr)分泌具有免疫负调作用的新型细胞因子，由p35和EBI3亚基通过二硫键结合形成。作为IL-12家族的一员，IL-35通过抑制IL-17等效应分子发挥免疫调节作用,研究表明,Tr、IL-35和Th17参与了自身免疫性疾病、炎症与肿瘤的免疫调节。【1】 研究现状 T淋巴细胞 CD4表达于60%~65%T细胞及部分NKT细胞，巨噬细胞和树突状细胞。CD4+Th细胞不仅在CD8+CTL激活中起重要辅助作用，本身也能产生细胞因子参与抗肿瘤，趋化因子能招募CTL和巨噬细胞等到肿瘤局部发挥效应，IFN可激活巨噬细胞，增加其对肿瘤细胞的吞噬和杀伤作用，TNF诱导肿瘤细胞凋亡。CD4+T细胞也可直接杀伤肿瘤细胞。 CD8+T细胞接受抗原提呈细胞的信号和CD4+Th细胞释放的细胞因子共同作用下分化为CTL。CTL是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。 实验设计 本实验将通过观察CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况,检测血清IL-12、IL-2和IFN-γ浓度等指标，探讨IL-35对肝癌小鼠T淋巴细胞的影响。经相关文献的数据得，若仅注射pxx-neo质粒，肿瘤细胞周围很少浸润CD4+和CD8+淋巴细胞，所以本实验通过注射pxx-IL-12来使浸润结果明显。 实验设计 实验室要求 实验步骤 观察指标 统计分析 预期实验结果 实验设计 实验室要求 ——实验仪器 小鼠IL-12、IL-2和IFN一Y检测试剂盒(购自美国RD公司) 荧光显微镜 注射器 组织匀浆机 恒温水浴箱 切片机 实验设计 实验室要求 ——实验对象 32只8一12周龄雄性BALB/c小鼠（购自XX公司）。 实验设计 实验室要求 ——药品试剂 小鼠肝癌细胞 1mg/ml胶原酶 抗CD4、CD8抗体及其对照抗体 pXX(质粒)-IL-35 1g. pXX(质粒)-IL-12 1g. pxx-neo 1g. 10%马血清 0.1%DAPI 实验设计 实验步骤 ——建立肿瘤模型 小鼠皮下接种体外传代的BNL肝癌细胞 待肿瘤长至1cm时 将肿瘤取出、碾碎,溶于30mlIV胶原酶(1mg/ml) 置37℃消化30min,平衡盐溶液洗涤 以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为1×106，制成肿瘤细胞悬液 每只小鼠皮下接种1x106皮下传代的BNL细胞。 实验设计 实验步骤——小鼠分组 组别（n=3） 组名 处理 第一天 第三天 之后几天 备注 1 IL-35高浓度组 接种BNL细胞 经尾静脉高压注 pXX-IL-35 12.5ug +pXX-IL-12 12.5ug 观察肿瘤生长情况,测量肿瘤相互垂直的最大径,以面积表示肿瘤大小,记录肿瘤生长曲线 至肿瘤生长大于2cm或出现明显溃疡时处死荷瘤鼠,终止实验。观察肿瘤淋巴细胞浸润情况。 2 IL-35中浓度组 接种BNL细胞 pXX-IL-35 7.5ug +pxx-neo 5ug +pXX-IL-12 12.5ug 3 IL-35低浓度组 接种BNL细胞 pXX-IL-35 2.5ug+pxx-neo 10ug+pXX-IL-12 12.5ug 4 对照组 接种BNL细胞 pXX-neo 12.5ug+pXX-IL-12 12.5ug 实验设计 观察肿瘤淋巴细胞浸润情况 终止体内实验时,取皮下肿瘤行冰冻切片,将切片室温下用10%马血清封闭后,分别加入抗CD4、CD8抗体(l:50稀释)室温反应lh,洗涤后加人荧光标。 记二抗室温反应lh,0.1%DAPI复染细胞核后,荧光显微镜观察CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况,每个标本观察5个高倍视野。 实验设计 实验步骤——小鼠分组 组别（n=5） 组名 处理 第一天 第三天 1 IL-35高浓度组 接种BNL细胞 经尾静脉高压注 pXX-IL-35 12.5ug +pXX-IL-12 12.5ug 注射后8、24、48、72h和168h后处死小鼠并采血,检测血清IL-12和IFN-γ浓度 2 IL-35中浓度组 接种BNL细胞 pXX-IL-35 7.5ug +pxx-neo 5ug +pXX-IL-12 12.5u