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分离方法 用途: 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。 分离方法 具体操作方法如下： 点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环（见图1），在酒精灯火焰上烧灼接种环，待冷，取待测菌液一环。 左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种（见图2）。 分离方法 接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将平皿的底朝上，放置在37℃孵箱内孵育24h。 取出后观察琼脂表面的菌落分布情况（见图3），注意观察最后1～2区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、色素等情况）。 细菌的生长状况观察 原理 ◆细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长，其生长状态不同。不同细菌在同一种培养基中生长，生长特点也不相同。这些区别称之为培养特征，是鉴别细菌和细菌分类的依据之一。 ◆ 把细菌接种在固体培养基上，在适宜的条件下经过一定时间的培养，在培养基表面（或内部）形成肉眼可见的有一个细菌大量繁殖后而成的集团，称之为菌落。不同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。 普通琼脂平板　　牛肉膏　　　 3.0g 　　蛋白胨　　 　 10.0g　　氯化氯化钠（NaCL）　 5.0g　　磷酸二氢钾（KH2PO4）　 1.0g　　琼脂　　 　 15.0g　　蒸馏水　　　 1000mL　　混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45℃倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入15～20ml培养基，培养基过少，划线分离时细菌的营养较少，菌落生长过小，菌落形态不易观察，培养基也易于干燥，不易在数天内对菌落形态进行观察。 含糖培养基灭菌条件115℃，10～15分钟 一般培养基灭菌条件121℃，15～20分钟 细菌的生长状况观察 * 图1 接种环的握持方法 图2 平皿的握持方法 或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火焰，右手持接种环在琼脂表面的一端（即1区，约占整个平皿的1/6～1/5）涂布，划线时，接种环与琼脂表面呈 30°～40°的角度轻轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环通过1区划线数次，在2区作连续划线，各线条间隔要小，但不能重叠。划满平皿的1/5～1/4区域，划完2区不需烧灼接种环，继续通过2区数次，在3区作连续划线，如此反复至划完整个平皿（如图3）。 1区 4区 3区 2区 图3 划线分离的方法 左：分区 右：培养后的结果 在无菌平皿中，倒入溶化后50℃普通营养琼脂培养基，每皿约 20毫升，水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌株分区划线，37℃培养24h。 菌落形态观察： 大小：以毫米计。 形状：圆形、不规则形、放射状等。 表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。 边缘：整齐、波形、锯齿状等。 色素：有颜色，颜色，是否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。 1.吲哚试验 2.甲基红试验 *