实验叶绿体色素的测定和分析要点.pptVIP

实验五 叶绿素的提取、理化性质和含量测定 1. 实验目的 提取叶绿素 叶绿素的物理性质 叶绿素的化学性质 叶绿素含量的测定 2. 实验原理 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质 吸收光谱 荧光现象 2.3 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿体色素 叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴” 亲水的“头部”：镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合 亲脂的“尾巴”：叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性 2.2 叶绿素的物理性质 1) 吸收光谱 2) 荧光现象 3) 含量测定 1) 叶绿素的吸收光谱 3) 含量测定 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和645 nm； 叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（均为34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。 故叶绿素浓度 C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重 Chl: 强吸收区: 640-700nm(红) 400-500nm(蓝紫); 不吸收区: 500-600nm (呈绿） Carotene: 强吸收区: 400-500 (蓝紫); 不吸收区：500以上（呈黄色或棕色） 2.3 叶绿素的化学性质 1) 叶绿素的结构 2) 取代反应 3) 皂化反应 1) 叶绿素的结构 叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。???? 2) 取代反应 ① 稀酸 去镁 铜代 ②浓酸 去镁 水解 稀酸 叶绿素溶液与稀酸作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素； 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后的产物为铜代叶绿素等，深绿色； 浓酸 叶绿素溶液与浓酸作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。 3) 皂化反应 叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。 叶绿素与碱皂化的盐能溶于水，极性增大。 皂化分层 叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层 而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中 一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层 3 材料、试剂与配备 （1）材料 菠菜叶片 （2）仪器设备 研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶，分光光度计，水浴锅等 （3）试剂 95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂 4.1 叶绿素的提取 新鲜菠菜叶片，剪碎成小块（去掉中脉）混匀； 2. 称取剪碎的样品3 g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3 ml的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀； 3. 过滤到25 ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（ 直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 4.2 叶绿素的荧光 取3 ml叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光的颜色； 4.3 叶绿素含量的测定 取5 ml叶绿素溶液移入50 ml容量瓶，用乙醇定容。 1) 叶绿素吸收光谱 以95%乙醇作为空白对照，在400-700 nm之间，每隔20 nm读OD值，然后以波长为横坐标，以OD为纵坐标作图 2) 叶绿素含量（提取的原液稀释10倍后进行）测定 以95%乙醇作为空白对照，测OD652 4.4 叶绿素的化学性质 1) 取代反应 稀酸： 取5 ml叶绿素原液，一滴滴加入醋酸，观察颜色变化； 向上述加醋酸的叶绿素溶液中加少量CuAc颗粒，65℃水浴加热，观察其颜色变化。 浓酸 取5 ml叶绿素原液，一滴滴加入浓盐酸，观察颜色变化。 2) 皂化反应 取3 ml叶绿素原液，加1 ml 20% NaOH-甲醇溶液，摇匀， 65℃水浴5 min； 取出冷却后，先加3 ml苯，再加3 ml水（沿壁慢慢加