实验一动物细胞培养液消化液和冷冻液的配制要点.pptVIP

培养液：维持动物细胞生存和生长所需要的基本溶液 平衡盐溶液（Balanced Salt Solution, BSS） 用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液 天然培养基（Natural Medium） 主要来自动物体液（如血清）或组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 在细胞培养中使用最早，也最有效。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响实验产物的提取和实验结果的分析。 合成培养基（Synthetic Medium） 根据细胞生存所需物质的种类和数量，人工模拟合成，配方恒定。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。需补充部分天然培 养基，多用血清，效果更好。 消化液：分离组织、分散细胞的细胞分离液 胰蛋白酶液：使细胞间的蛋白质水解、细胞分散 常用浓度为0.25% 血清可终止其对细胞的消化作用 EDTA液：鳌合Ca2+、Mg2+，使细胞分离，对细胞毒性小 常用浓度为0.02% 冷冻液：用于细胞的冷冻保存 在细胞培养的基础液中加入一定剂量的血清和冷冻保护剂， 如二甲亚砜（DMSO）、甘油或乙二醇。 冷冻保护剂可使冰点降低，提高细胞膜对水的通透性，减少 细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 基本营养物质：氨基酸，维生素，碳水化合物，无机离子。 促生长因子等物质：血清中含多种促细胞生长所需的物质。 2 细胞的生存环境 温度： 37 ℃ 气体： O2和CO2 ， CO2 常用浓度为5% pH值：7.2-7.4 渗透压：260－320 mmol/L 3 无污染及无毒 常用实验用品 培养器皿：培养瓶，血清瓶，吸管，离心管，冻存管 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 培养瓶 血清瓶 培 养 板 配制培养液必须使用三蒸水或Millipore超纯水，不可用无离子水配制。 全自动高压灭菌锅 滤 器 原理 用比细菌直径(一 般为0.5-5μm)小的微 孔滤膜 (直径0.22μm) 将细菌从培养液中除 去，实际上为除菌而 非灭菌。 CO2培养箱 倒置显微镜 液氮罐 常用玻璃器皿清洗 1. 浸泡（自来水）:初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。 2. 刷洗（洗涤液）：刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。 3. 酸泡（24小时）：浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成的清洁液中。浸泡时间一般为过夜，不应少于6 小时。 4. 冲洗：需流水冲洗10次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次， 50℃烘干备用。 细胞培养用液的配制 基本步骤： 洗瓶子 消毒 培养液抽滤除菌 分装 培养液质量鉴定 水：三蒸水或Millipore超纯水，不可用无离子 水配制。 配洗涤液1600、消化液300 配培养液1600、基础液剩余除菌保存 冷冻液以后再配 用4袋DMEM DMEM基础液配方（1000ml） DMEM 13.5g（一个包装的干粉培养基 ） NaHCO3 3.7g HEPES 2.38g 青霉素 0.1g 链霉素 0.075g 调节pH值至7.2 加水定容至1L 用无菌0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌血清瓶中 4℃冰箱保存。 消化液 DMEM基础液＋0.25％胰蛋白酶(trypsin)＋0.02％EDTA-Na2 洗涤液 DMEM基础液＋5％胎牛血清（终浓度） 培养液 DMEM基础液＋10％胎牛血清（终浓度） 注意事项 1. 由于培养液是细胞赖以生存的环境，制备过程要操作严格，避免混入杂质，使用的成分应精心选择，必须用分析纯试剂。 2. 配制培养液时必须使用干净的药匙，在称取完一种试剂后必须用干净纸擦拭干净，在条件允许时每种试剂单独使用一把药匙，避免不同试剂间的交叉混合，影响培养效果。 3. 所有存放培养液的容器都必须事先严格清洗和高压灭菌；制备好的培养液要标注培养液名称、配制日期，并按不同培养液的要