数字PCR技术在HER基因扩增检测中的应用要点.pptVIP

数字PCR技术在HER-2基因扩增检测中的应用 HER-2 HER-2与乳腺癌 正常的HER-2基因位于17号染色体长臂上。于乳腺癌、卵巢癌等组织中常有高度的HER-2基因扩增与过度表达 HER-2基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面HER-2蛋白表达增加，导致HER-2主导的生长信号通路过度活跃 带有HER-2基因扩增的乳腺癌更易复发。相比HER-2扩增检测阴性的乳腺癌患者，阳性患者的恶化迅速，预后较差，生存期普遍缩短 检测HER-2是否高表达对于患者的预后判断、治疗方案的选择具有重要意义, HER-2基因的扩增比例是乳腺癌明确的预后指标和药物治疗效果的预测指标 常用靶向药物 赫赛汀等HER-2靶向药物均对带有HER-2基因扩增的癌症组织有着显著的生长抑制能力，但其价格不菲所以 ——  对HER-2进行扩增检测对癌症病人的用药与治疗策略至关重要 而检测方法的准确性则决定的该种检测方法在HER-2基因扩增检测上的地位 检测方法 目前，《乳腺癌HER2检测指南(2011版)》仍推荐IHC与FISH和(或)CISH相结合的检测策略 IHC(免疫组织化学)直接针对细胞表面的HER-2，快捷、便宜，最接近事实。通常缺乏参考标准，对样本要求较高 FISH(荧光原位杂交)为“金标准”，针对大片段DNA，但检测耗时、设备复杂且费用高昂。仍可能存在着假性结果 CISH(色素原位杂交)针对mRNA，相比FISH更能反映蛋白表达程度，但不稳定。因信号单一而缺乏直观的对照 分子水平上的检测对象 HER-2的扩增模式 HER-2基因绝大多数在17号染色体长臂上发生原位扩增，亦可能转座于其它染色体上。因维持染色体结构相对稳定，染色体的着丝点及其邻近基因极少出现原位扩增 原位扩增是HER-2基因扩增的典型模式，FISH法通过肉眼可直接观察到最真实的结果，是公认最常见的HER-2基因扩增模式。由于此情况多见，是本实验的研究对象 存在伴随着单个细胞内17号染色体数目的翻倍而使HER-2表达相对增多的现象，即17号染色体多倍化 强烈的信号刺激、上游存在强启动子等情况均可导致HER-2基因大量表达，尽管HER-2基因并不存在扩增 上述两种扩增模式极易导致DNA检测法（包括针对DNA的PCR和FISH）产生假阴性结果。而mRNA检测尤佳 方法设计 本文旨在验证数字PCR法对HER-2基因进行扩增检测的可行性，同时与常规的荧光定量PCR法以及FISH检测结果作比较 对收集的样本进行FISH检测，作为ddPCR结果的参照 通过适当设计HER-2基因与参照基因的引物与探针，以多套组合进行ddPCR 与FISH相同原理，HER-2基因与对照基因的拷贝数比值（HER-2/CEP17）可反映HER-2基因的扩增状况 设计理念：更特异、更精准地检测HER-2基因的扩增 引物、探针的设计理念 为何选用数字PCR？ 相比于荧光定量PCR 高灵敏度：只要存在，即可检出 绝对定量：真实可见的拷贝数 无需内标：杜绝假阴性结果 数字PCR 全称“微滴数字PCR技术(ddPCR)”，因其特色又称“量子PCR” 微滴化：一个PCR反应管包含了约2万个大小均匀、相互独立、互不干扰的“油包水”反应微滴 流式检测微滴的荧光分布，每个微滴都是独立的PCR反应结果，如量子般不连续。绝对定量。 PCR平台上新颖而直观的结果展示方式 结果处理 机器通过流式荧光检测器统计并给出总液滴数中带有HER-2标记荧光与CEP17标记荧光的液滴数目 通过计算HER-2基因与参照序列的拷贝数之比，即HER-2/CEP17，获得HER-2基因的扩增比例 以FISH检测结果对样本进行了分组（阴性、临界、阳性），作为ddPCR法于HER2扩增检测结果的参考 ddPCR法与FISH法的HER-2扩增检测结果对照 数据规律 对于均一细胞属性的样本，由ddPCR所得的理想HER-2/CEP17值应是自然数，如正常人体组织的HER-2/CEP17值应为1（1条染色体只有1个HER-2基因与1个差丝点） 肿瘤样本细胞组成复杂（肿瘤组织比例低下时尤为明显），PCR过程之中伴随的各种随机现象，HER-2/CEP17值总会出现一定偏离。当样本量足够大时，可以发现HER-2/CEP17值总体趋向分布于2，3，4，5等自然数附近 与NCCN制定的FISH结果判定不同，理论上在ddPCR检测法中的HER-2/CEP17值接近或大于2即可判断为HER-2基因存在扩增，并无1.8-2.2的临界复检范围，即ddPCR的HER-2基因扩增鉴定标准相比FISH将更为狭窄，也更有利于样本对HER-2扩增的准确判断。 评价 结果准确，与FIS