禾谷镰孢菌beta;2-微管蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化.pdfVIP

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2016-02-27 发布于安徽
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禾谷镰孢菌beta;2-微管蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化.pdf

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中国农业科学 2012,45(6): 1084-1092 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.06.006 禾谷镰孢菌β-微管蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化 2 1，2 1 1 1 徐建强，周裕军，张聪，周明国 1 2 （南京农业大学植物保护学院/农业部作物病虫害监测及防控重点开发实验室，南京 2 10095；河南科技大学林学院，河南洛阳 471003 ）摘要：【目的】在大肠杆菌中表达禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）的β-微管蛋白，筛选使β-微管蛋 2 2 白可溶性表达的诱导因子，并对可溶性蛋白进行纯化。【方法】以构建好的质粒（pET32a+- β-tubulin）为模板， 2 PCR 扩增出 + β-微管蛋白基因，将其克隆到pET30a 表达载体上，并转化到表达宿主菌BL21(DE3)及Rossatta （DE3） 2 pLysS，筛选阳性克隆，进行蛋白诱导表达，并筛选蛋白可溶性表达的诱导因子；对纯化后的蛋白进行 SDS 和 Western blot 验证。【结果】获得了在大肠杆菌中表达效率高的阳性克隆；为了克服常规诱导条件下表达的β- 2 微管蛋白主要以包涵体形式存在的问题，通过对诱导温度、时间、诱导物浓度、初始诱导时的菌液浓度、培养液及宿主菌等六因子的综合分析，获得了β-微管蛋白可溶性表达的优化条件；利用HisTrap HP 预装柱对β-微管 2 2 蛋白进行纯化，可获得纯度很高的可溶性β-微管蛋白；SDS确认表达出的融合蛋白分子量为 51.6 kD； 2 Western blot 证实表达的融合蛋白能与6×His 及β-微管蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。【结论】本研究为外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达提供了参考；获得的微管蛋白为研究微管蛋白靶标类药物的抗性机制以及生产中开发新的以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。关键词：禾谷镰孢菌；β-微管蛋白；包涵体；可溶性表达；纯化