核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(2):344-356 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.014 核桃NBS 类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性 1 1,2 安海山 ，杨克强 1 2 （山东农业大学林学院，山东泰安271018 ； 作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018 ） 摘要：【目的】利用同源序列法分离核桃的NBS （Nucleotide binding site）类抗病基因类似物，为核桃抗 炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。【方法】以35 个核桃优系为试材，利用接种法鉴定供试材料对 炭疽病的抗性；根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop 和GLPL 设计简并引物，以核桃优系的基因组DNA 为 模板，通过PCR 扩增NBS 类抗病基因同源序列片段，并分析所得NBS 类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的 关系；利用BLASTN/X 程序对所得NBS 序列在GenBank 数据库中进行同源性搜索；利用MEGA 5.2 及DNAman 7.0 等 软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究。【结果】35 个供试核桃优系中，有20 个优系为抗炭疽病类型（R）， 其相对抗性指数在0.63—0.82；有5 个优系为中抗类型（M），相对抗性指数在0.27—0.56；有10 个为感病类型 （S），相对抗性指数在0.00—0.21。PCR 结果显示，从20 个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20 条NBS 类抗病基 因类似序列；而在其它15 个优系（5 个中抗优系和 10 个感病优系）中未扩增到条带，表明核桃NBS 序列与炭疽 病抗性相关联。BLASTN 显示，所得NBS 序列在核苷酸水平与GenBank 中已知的核桃NBS 序列(jrRGAPGs)存在89% —100%同源性，与其它物种NBS 序列的同源性在69%以上；BLASTX 显示，所得NBS 序列与已知核桃NBS 抗病蛋白 同源性为77%—99%，与其它物种的NBS 抗病蛋白同源性在 49%—66%。氨基酸序列多重比对分析表明，所得核桃 NBS 序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域，如P-loop、kinase-2、kinase-3 和GLPL 等，在典型功能域的 核苷酸多态性（Pi）明显低于非保守区，有较高保守性。系统发育分析表明，在核苷酸水平上可将所得核桃优系 的NBS 序列区分为7 类，在氨基酸水平上可分TIR 和non-TIR 两大类7 个亚类；所得核桃NBS 序列非同义替换率 (dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS 在0.00—0.95，为纯化选择。氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS 亚类 间的相似度为28.3%—63.5%，与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0%—48.5%。【结论】核桃NBS 类抗 病基因类似物与炭疽病抗性相关联，NBS 序列与其他物种抗病基因有较高同源性，包含抗病基因保守的功能域， 在进化上为纯化选择。 关键词：核桃；炭疽病；抗病基因类似物；核苷酸多态性；系统发育分析 Sequence Analysis of NBS-Type RGAs and Their Relationship with Anthracnose Resistance in Walnut 1 1,2 AN Hai-shan , YANG Ke-qiang 1 2 （College