土壤中纤维素分解菌的分离要点.pptVIP

* * 专题二 微生物的培养与应用 课题3 分解纤维素的微生物的分离 一、课题目标 简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分离出分解纤维素的微生物，讨论这类微生物的应用价值。 二、课题重点与难点 从土壤中分离分解纤维素的微生物。 （1）纤维素酶分解纤维素生化原理 （2）区别选择培养与鉴别培养概念 （3）比较纤维素粉培养法与刚果红染色法原理 三、基础知识 （一） 纤维素与纤维素酶 1.纤维素在生物圈的分布； 人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质.植物的根茎叶等器官都含有大量的维生素.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨. 2.纤维素酶的结构和作用原理 纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。纤维素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷键连接而成的，淀粉是由葡萄糖分子按α-1,4糖苷键连接而成的。 纤维素酶(复合酶) 内切酶（Cx酶） 外切酶（C1酶） 葡萄糖苷酶 内切酶作用于无定型的纤维素区域，使纤维素断裂成片段 又叫纤维二糖水解酶，它可以作用于纤维素的结晶区或小片段纤维素，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖 将纤维二糖分解成葡萄糖。 （二）纤维素分解菌的筛选 1.刚果红染色法； 2.刚果红染色法的原理。 四、实验案例 土壤中纤维素分解菌的分离 实验的具体操作步骤如下: 1.土样采集? 土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。 2.选择培养? 选择培养需要的仪器有：250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计等。 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 选择培养的操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。 3.刚果红染色法分离? 纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装有9mL无菌水的20 mL大试管，温箱等。 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。 制备菌悬液： 按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。 涂布平板： 将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30 ℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资料三］。 五、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落： 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 （二）分离的结果是否一致： 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。 1.本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ 答：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。 2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相