禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达.pdfVIP

中国农业科学 2009,42(8):3003-3008 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.08.046 禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达 1,2 1 1 1 1 王永娟 ，沈鹏鹏 ，张鑫宇 ，夏晓莉 ，孙怀昌 1 2 （扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009 ； 江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州 225300 ） 摘要：【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA（short interference RNA，siRNA）的禽U6启动子。【方 法】以鸡基因组为模板进行 PCR 扩增，将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析，并将其插入报告基因载体 pEGFP-N1中，获得siRNA表达载体pGFP-U6，将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA（short hairpin RNA）插入其中，获得pGFP-U6-shRNA；以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照，分别转染COS-1 和DF-1细胞，用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆的U6启 动子位于鸡 28 号染色体，与发表的鸡 U6-3 启动子同源性为 97.2%，含多个 Oct-1 序列，不含 CACCC 框、SPH 和 PSE 等聚合酶Ⅲ启动子序列，TA 框不典型；在 pGFP-U6-shRNA 转染的哺乳动物源 COS-1 细胞培养中，GFP 阳性细 胞数和荧光总量均有所下降，但不如pGFP-H1-shRNA转染细胞显著；在pGFP-U6-shRNA转染的禽源DF-1 细胞培养 中，不仅GFP 阳性细胞数和荧光总量显著下降，而且基因沉默效果显著优于pGFP-H1-shRNA转染细胞。【结论】成 功克隆的禽U6 启动子不仅能有效转录siRNA，而且转录活性具有相对的细胞种属特异性。 关键词：禽U6 启动子；克隆；序列分析；转录活性 Cloning, Sequence Analysis and Transcription Activity of a Chicken U6 Promoter 1,2 1 1 1 1 WANG Yong-juan , SHEN Peng-peng , ZHANG Xin-yu , XIA Xiao-li , SUN Huai-chang 1 2 ( College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu; Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College, Taizhou 225300, Jiangsu) Abstract: 【Objective 】 To cloning avian U6 promoter for construction of short interference RNA (siRNA) expression vector