柑桔衰退病毒的速检测技术研究.pdf

摘 要 Tristeza 由柑桔衰退病毒(Citrus Virus，CTV)引起的柑桔衰退病是世界性的柑 桔病害，对柑桔产业造成了严重威胁，巴西等南美国家曾一度因此病危害而使柑桔 产业濒临崩溃。在我国浙江、四川、广西等一些柑桔产区，柚子和甜橙普遍受到衰 退病毒的侵染而表现茎陷点症状。开展CTV的快速检测研究对其防治具有极为重要 的作用。为建立和优化CTv检测方法，提出柑桔样品中cTv的检测技术流程，本 研究采用生物学、组织学、免疫学和分子生物学检测方法，对HB柚、PG杂柑、GL 橙、AW橙、鱼橙、霜橙、本地早、林娜脐橙8个品种进行了检测分析，并对各种 检测方法的优缺点进行了比较。 利用墨西哥来檬、酸橙、杜肯葡萄柚和Madamvinous甜橙作为指示植物检测 鉴定CTV分离物TR-LSl4及分离自本地早和林娜脐橙的分离物。3种分离物接种到 指示植物后都产生了典型症状，分别被初步判断为苗黄株系、茎陷点株系和弱毒株 系。指示植物的病叶叶柄和主脉徒手切片，经苯胺蓝染色后，在韧皮部组织内观察 到紫色的病毒内含体，薄壁组织和木质部均不着色。 鱼橙、霜橙、本地早、林娜脐橙8个品种的春梢、夏梢和秋梢。林娜脐橙、AW橙 和鱼橙3个品种为阳性，但春稍和秋梢的P／N值要明显高于夏梢。用生物素一亲和 霜橙和本地早5个品种为阳性。以枝皮和嫩叶作检测材料效果良好，以老叶作检测 材料，不管是什么品种，还是春梢、秋梢、夏梢，均检测不出CTV。组织印迹法检 测鱼橙、AW橙、林娜脐橙和GL橙4个品种，其枝条横切面印迹均染上紫色，颜 色的深浅与ELISA检涣《的P／N值成正比。通过印迹可以直观看出CTV在韧皮部内 分布不均匀，枝条顶端的病毒含量要高于末端。 行聚丙烯酰胺凝胶电泳。6个样品带型相近，都有A、B、D、E四条带，但是本地 林娜脐橙、鱼橙和AW橙在c带和D带之间还有一条比较模糊的带。dsRNA分析 虽然可以检测CTV，但dsRNA的带型与分离物的生物学特征并不相关，表明dsRNA 用来鉴定CTV株系不准确。 提取柑桔叶片总RNA作为模板进行一步法RT．PCR检测以上8个样品的春梢和 夏梢，林娜脐橙、本地早、鱼橙、AW橙和霜橙5个品种的春梢和夏梢均为阳性。 liB柚的春梢检测为阳性，但夏梢为阴性。同一品种其夏梢扩增的目标片段的亮度远 没有春稍高，进一步说明CTV随着气温的升高在柑桔组织内的含量急剧下降。 IC-RT-PCR检测以上8个样品的秋梢，林娜脐橙、AW橙、鱼橙、霜橙和本地 橙3个品种的夏梢，两种方法均扩增出354bp的目标片段。但对于同一材料， TC-RT-PCR扩增目标带的亮度不如IC—RT—PCR。ICNested RT-PCR检测霜橙、本地 的liB柚在此次检测中为阳性。 以粗提纯的病毒作SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白质转移到PVDF膜 上进行westem 推断为CTV的衣壳蛋白。 通过比较以上各种检测方法的优缺点，我们认为TAS-ELISA或组织印迹可作为 标准的血清学检测方法：免疫捕捉RT-PCR或巢式PCR可作为标准的分子生物学检 测方法。在此基础上，我们总结出综合运用生物学、血清学和分子生物学方法检测 CTV的流程图。 。 IC-RT-PCR；TC-RT-PCR；1(2Nested blot RT-PCR：we,stem 2 Abstract Citrus a CitrusTristeza Tristeza worldwidediseaseof disease,causedby Virus,is hadoncebeen ha