无脊椎动物家蚕材料的 肝毒性模型实验动物替代研究.pdf

无脊椎动物家蚕为材料的肝毒性模型实验动物替代研究 中文摘要 中文摘要 实验动物替代方法，已广泛应用于生命科学研究领域。家蚕是鳞翅目模式昆虫，有着数千年 畜牧化养殖历史，且已积累了系统深入的生理学、病理学和毒理学资 。家蚕遗传突变资源的创 新及其在基础生命体系、物质代谢、能量代谢和遗传方式上与哺乳类有众多相似性的发现，使家 蚕作为中国特色的模式昆虫正逐渐向实验动物模式化发展。然而，如何通过系统地控制实验用家 蚕的遗传因素和生长环境，实现家蚕 “实验动物化”，如何根据家蚕的生物学特性，优选出替代 方法研究类型，是家蚕在成为标准的实验动物过程中所必须突破的瓶颈。另外，家蚕与小鼠等经 典哺乳类模式动物相比，在外源化合物代谢动力学方面究竟存在哪些共性和差异，国内外也尚无 系统的研究。 本研究以家蚕实验动物化的标准建设为目的，总结了家蚕实验动物化的品种选育、饲养管理、 设施管理等规范，设计了家蚕标准化饲养微屏障系统；通过肝毒性模式药物对乙酰氨基酚（APAP） 处理，系统地比较研究家蚕与哺乳动物体内APAP 的急性毒性分级和药代动力学特性；通过代谢 组学方法、高通量分析 （RNA-Seq）方法调查APAP对家蚕内源性代谢物和基因表达的差异，揭 示APAP在体内所产生的生物效应；用试剂盒检测APAP染毒后家蚕催化药物代谢关键酶的活性， 并通过生物信息学方法分析比较家蚕与小鼠等哺乳类在这些关键酶进化上的差异及活性位点差 异。研究获得的主要结果如下： 1. 模药APAP对家蚕的急性毒性分级、药代动力学特征能够为医学实验动物替代建立平行数据 急性毒性试验结果显示，APAP对家蚕毒性因品种不同而表现出毒性敏感性不同，大造较皓 月敏感。APAP处理雌、雄大造品种的LD50分别为2017±254μg/g和216 ±300μg/g。急性毒性 分级为中低级毒性，与哺乳类相似。 代谢动力学结果表明，低浓度600μg/g剂量和高浓度3600μg/g剂量APAP在家蚕体内的药 动学呈一室开放型模型，消除半衰期（t ）分别为1.06h和2.77h；原药达峰时间（t ）分别为 1/2 max 0.50h和1.00h；原药达峰值浓度（C ）分别为67.6 μg/ml和568.73μg/ml。相对生物利用度 max （AUC ）分别为：222.63h•μg/ml和 1976.32h•μg/ml。代谢中间产物有N-乙酰对苯醌亚胺 0-t （NAPQI）产生，与哺乳类相比，药物吸收分布、体内代谢中间产物、总体的动力学(PK)相似， 能为医学实验动物替代建立平行数据。 2. 模药APAP在家蚕的体内能产生与哺乳类共同的生物效应 代谢组学分析显示，以600μg/g剂量APAP经口给药家蚕8h后，循环血中差异代谢物在三 羧酸循环、糖酵解途径、氨基酸代谢、黑色素生成等途径中，说明APAP在体内所产生的毒性途 径主是因为药物代谢过程中产生了氧化应激，影响了体内能量供给、物质转运和信号传导。 I 中文摘要 无脊椎动物家蚕为材料的肝毒性模型实验动物替代研究 代谢物差异分析发现，APAP诱导家蚕血淋巴中氨基酸代谢产生差异，推测氨基酸代谢的异 常和苹果酸、琥珀酸、延胡索酸等内源代谢物的显著下降相关，也与APAP染毒后产生的氧化应 激相关。酪氨酸、多巴、海藻糖的显著升高进一步证实过量的APAP导致了氧化应激的产生；APAP 诱导家蚕的胆固醇降低，却使β-羟基β-甲基戊二酸升高，表明APAP导致家蚕的胆固醇合成途径 失衡，甾体激素的原料供给障碍影响机体的激素调节。 3. 模药APAP在家蚕的体内能产生与哺乳类共同的药理作用和毒性机理 RNA-Seq结果分析APAP给药实验组与对照组的差异基因表达显示，在KEGG分析系统中 与新陈代谢相关的通路里，大量的差异表达基因富集于三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸的氧化、 糖酵解和糖异生等高产能环节，从基因表达水平上进一步证明，APAP对家蚕机体的伤害，主要 是氧化应激和能量代谢、物质转运、信号传导等途径异常所至，这与哺乳类所产