液相色谱法要点.pptVIP

* * 第20章 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography HPLC 本章主要内容 ★ HPLC的特点（与经典液相色谱和气相色谱比较） ★ 提高HPLC柱效的方法 ★ HPLC的仪器结构及其主要部件 ★ 几种常见的HPLC方法的原理及应用 Akta explorer高压层析系统－紫外在线检测 一、高效液相色谱（HPLC）的概念 用高压输送（最高输送压力可达4.5?107Pa）流动相（液体），用以特殊方法用小粒径填料（固定相）填充而成的色谱柱分离，同时柱后连有高灵敏度检测器，可对流出物进行连续检测的液相色谱 HPLC是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的 §20-1 概述 二、与经典液相色谱的比较 ~ 10min 0.5 ~1天 分离时间 50~200atm 1~10atm 使用压力 4~10?m 150~200?m 填充物粒度 15~50cm 50~100cm 柱长度 ~ 0.4cm 1~5cm 柱内径 HPLC 经典LC 1、基本特点 高效、高速和高灵敏度 GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，在分离 中只起运载作用，对组分作用小； HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供 选择的机会多；它除了起运载作用外，还对分离产生 很大贡献（分离可通过流动相控制或改进） 2、操作条件 HPLC的分离速度、柱效和灵敏度均低于毛细管GC 三、HPLC的特点（与开管气相色谱比较） 流动相对分离起重要作用，且可以选择的流动相种类很多 GC常在高流速和高温下进行； HPLC常在低流速和室温下进行。 流动相流速与操作温度低 三、HPLC的特点（与开管气相色谱比较） 3、影响柱效有差别 开管GC中无涡流扩散项，柱内效应主要由分子扩散决定 HPLC中分子扩散可以忽略，柱内效应主要由涡流扩散和 传质阻力决定 柱内效应的影响因素与程度不同 操作压力高 GC采用低压 5?105Pa 分离； HPLC采用高压（ 50? 350 ?105Pa）分离 2、操作条件 ★GC采用程序升温提高分离速度与分离效率，实现沸 点相差很大的混合组分之间的分离 ★HPLC采用梯度洗脱提高分离速度与分离效率，实现 极性相差很大的混合组分之间的分离 三、HPLC的特点（与开管气相色谱比较） 4、分析对象及范围更广： GC只限于气体和低沸点热稳定化合物 占有机物总数的20% HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物（占 有机物 总数的80%） ， 3、影响柱效有差别 柱外效应影响大 HPLC的柱外效应比毛细管气相色谱严重 提高HPLC柱效的方法 ★ 恰当提高柱温 ★ 减少填料的粒径和空穴深度 ★ 采用低粘度和低流速的流动相 ★ 减少柱外死体积 §20-2 高效液相色谱仪 一、HPLC仪器的结构 流动相储器和溶 剂处理系统 高压泵系统 进样系统 液相色谱柱 检测器 1、基本组成： 贮液器 高压泵 检测器 梯度淋 洗装置 色谱柱 压力表 进样器 馏分 收集器 记录仪 进样系统 分离系统 检测系统 附属系统 一、HPLC仪器的结构 2、HPLC仪器的结构及工作流程 高压输液系统 柱温箱 二、流动相储器和溶剂处理系统 1、贮液器 配有孔径约为2?m 溶剂过滤器 配有溶剂脱气装置 2、流动相输入方式 等度洗脱方式 梯度洗脱方式 在分离过程中，流动相的组成与性质保持稳定 在分离过程中，流动相的组成与性质按一定方式改变，以缩短分离时间，提高分离效率 梯度洗脱方式类似与GC中的程序升温分离，主要用于极性差别很大的混合组分分离 三、高压泵系统 1、高压泵 （1）对高压泵的要求 有足够的输出压力且压力恒定、脉动小；输出流量恒定且范围可调；便于迅速更换溶剂；耐腐蚀 （2）高压泵的种类 往复式塞泵 2、流速控制和程序系统 恒压力泵 螺旋注射泵 四、进样系统 直接注射进样 ——使用微量注射器进样 特点：装置简单、死体积小；但进样量小且重现性差。 高压六通阀进样 装入样品 出口 进样 采样环 泵入溶剂 进色谱柱 特点：进样量可变范围大，进样准确，重复性好。 自动进样 特点：进样量可变范围大，进样准确，重复性好，一 次可 连续进样上百个，适合于大量试样自动化分析。 进样阀 五、色谱柱（分离系统） ——色谱仪的心脏 1、色谱柱组成与种类 要求 ——耐高压、柱接头的死体积小 材料 ——内壁光滑的优质不锈钢或其它金属 形状 —— 柱长多为10~50cm，内径为4~5mm 柱管 固定相 颗粒小（一般为20~75 ?m；高效柱为3~10 ?m） 填充均匀 填充方法：多彩用匀浆法 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，防止堵塞。 加