《2016-7 第三章 第二节蛋白质定量分析0415》.pdf

第二节 蛋白质定量分析 荧光分析法 1 分子荧光光谱法 Molecular fluorescence spectroscopy • 光致发光和分子荧光光谱法 • 荧光光谱法基本原理 • 荧光分析仪器和荧光法的应用 2 光致发光（Photoluminescence ）: 荧光和磷光是分子 吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致 发光。 分子荧光光谱法--基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法 特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★线性范围宽； ★选择性比吸收光谱法好; ★具有多种测定参数; ★多种检测技术和方法 ★应用范围不如吸收光谱法广。 3 一、荧光光谱法基本原理 • 1.1 分子的激发与失活 • 1. 分子的多重态 • 单重态 一个所有电子自旋都 配对的分子的电子状态。 • 三重态 有两个电子的自旋不 配对而平行的状态。 • 激发三重态能量较激发单重态 低。 4 2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态。 5 1.2 荧光参数 荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F） 与荧光物质的吸光程度及其发射荧光的能力有关。 1. 荧光强度与浓度的关系 F = KФ （I —I） 0 I0——入射光强度； I——透射光强度； 荧光量子产率（Ф）。 6 根据朗伯- 比尔定律， lg I 0 = εbc I I=I e-2.303ε bc 0 F=k’I (1-e-2.303 ε bc) 0 假设εbc＜0.05 F = 2.303 ФI εbc 0 当I 一定时 F = K·C (K = ФI 2.303 εb) 0 0 即在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度 成正比，这是荧光法定量的基础。 7 2. 荧光量子产率Φ 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示： 发射荧光的分子数 发射的光子数 Φ = = 激发态的分子数 吸收的光子数 Φ与失活过程的速率常数k有关： k f Φ=