原位PCR技术摘要.pptVIP

⒈ 原位PCR扩增同直接法，但dNTP不需标记； ⒉ PCR扩增后进行原位杂交 （二）间接法原位PCR扩增 ⑴2×SSC杂交液配制Dig-标记特异性探针，探针浓度5ng/每片，20μl/每片，用前探针95℃变性10min； ⑵ 滴加探针，95℃ 5min，42℃温盒中杂交过夜； ⑶ 取掉盖玻片，4×SSC洗，室温2min； ⑷ 2×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC，42℃洗各10min×2； ⑸ 加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体复合物，37℃，2h； ⑹ 碱性磷酸酶(NBT/BCIP)暗处显色； ⑺ 终止反应，封片观察。 （三）原位RT-PCR扩增 ⒈ 样本制备，蛋白酶消化均同直接法； ⒉ DNA酶处理（780u/ml浓度的不含RNA酶的DNA酶）可过夜。 ⒊ 反转录反应 表10-1 反转录和PCR反应液配方* ? 反转录反应液 PCR反应液 10×缓冲液 1× 1× MgCl2 5mol/L 4.5mmol/L 每一种dNTP 250μ mol/L 200μ mol/L 每一种引物 2μ mol/L 1μ mol/L Taq DNA聚合酶 － 8U/100μl BSA － 3μg/ml 甘油 － 10% AMV逆转录酶 0.4U/μl － RNA酶 2U/μl － 加水至 30μl 40μl *用于约3cm2的组织切片 以RNA为模板，通过反转录合成cDNA。将逆转录反应液20μl（含AMV逆转录反应酶和正义上游，反义下游引物）加在组织切片上，覆以新鲜的蜡膜，并用弹力盖片封剂（Ohcor，Gathersburg，MI）将蜡膜封好，42°c孵育60min。 孵育过程可在普通的PCR热循环仪上进行。在循环仪的加热台上铺上一层，将玻片置于上，热循环，加一塑料盖，使之密封。反转录结束后，PBS洗60min。 * * 原位PCR技术 原位PCR技术是一项极为敏感的原位显示、检测生命话性物质DNA或mRNA的示踪染色方法，它是核酸扩增与原位核酸杂交相结合的产物。特点是特异、灵敏、原位，检测阈值低，能达pg和fg水平，甚至可检出单拷贝的核酸序列。 此项技术的基础是原位杂交技术（第八章）和液相PCR技术，前者是指应用标记的探针检测细胞内RNA、DNA的原位示踪染色技术，它比PCR技术更早应用于石蜡切片、冰冻切片、细胞等内源性或外源性DNA、RNA的检测。 原位杂交技术的优点是组织形态保存好，特异性较高，成本低，不需特殊仪器。缺点是敏感性较低，但可通过改变检测手段的敏感性，或经原位核酸扩增后再行标记探针检测（间接原位PCR法）来提高检测效率。 近年来，随着现代工业和分子生物学技术的飞速进步，核酸水平的原位检测方法也同样得到了长足发展，新技术、新方法层出不穷，除原位杂交和原位PCR外，又出现诸如：荧光原位杂交（FISH）；寡核苷酸引物原位DNA合成技术（PRIN）和比较基因组杂交技术（CGH）——第九章； 组织和细胞芯片技术（又叫微阵列技术（microarray technology）——第十一章；等等。限于时间，本次课只讨论第十章“ 原位PCR”技术，因为它多用，又与其它新方法有关联。其它章节内容，仅供同学们选用时参考。 根据实验设计，原位PCR可分为直接法、间接法、原位反转录、原位再生或序列复制反应等类型。 第一节 原位PCR技术操作 载盖玻片的清洁和组织切片的预处理，包括防脱片、蛋白酶消化等，基本上与原位杂交法类同。 一、待测切片的准备和预处理 配制0.05%/0.01 mol/L Tris-Hcl，pH8.0多聚赖氨酸，每10ml 0.05%多聚赖氨酸中加入1μl TritonX-100,可保存于4℃，出现浑浊则不能使用。 （一）清洁玻片并进行防脱片处理 清洁的玻片置上述液体中20min，室温，然后60℃ 1h，玻片于室温中可保存1个月备用。 处理的玻片上加1～2滴aqueous胶，组织敷贴其上，45℃加热，再将切片烤干60℃ 90min，冷却20℃，24h，室温保存。 （二）组织切片4～10μm 最后以0.1mol/L Tris-Hcl,pH7.4洗5min。 （三）石蜡切片脱蜡至水 溶解蛋白酶K于0.1mol/L Tris-Hcl, pH8.0/10mmol/L EDTA（蛋白酶K浓度：组织片为10μg/ml，细胞片为20μg/ml），消化时间依蛋白酶浓度，不同组织而异，一般为20min。消化结束后95℃，2min灭活蛋白酶，0.1mol/L Tris-Hcl, pH7.4洗。 （