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家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3 及相互作用蛋白研究 中文摘要 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3 及相互作用蛋白研究 中文摘要 丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因家族，参与调节生物体内多种生理反应。为深入研究 丝氨酸蛋白酶抑制剂及互作因子在家蚕免疫防御中的作用机制，本文以家蚕为材料， 做了如下研究：以脂肪体 cDNA 为模板克隆了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin-3 ） 基因。利用原核表达系统表达了 Bmserpin-3 的编码区，并纯化了表达产物，利用纯 化的蛋白，研究了Bmserpin-3 参与家蚕黑化作用的机理；采用His-pull down 技术筛 选了与家蚕 serpin-3 相互作用蛋白；用 RNAi 结合荧光定量 PCR 的方法研究了 Bmserpin-3 对靶标蛋白的调控。主要研究结果如下： 1 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3 基因的克隆 本实验以家蚕幼虫脂肪体 cDNA 为模板，扩增获得了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂 serpin-3 的基因序列（GenBank 登录号NP_001040318.1 ）。克隆的家蚕serpin-3 基因 开放阅读框含1311 bp ，编码458 个氨基酸，预测蛋白质分子量约为49.33 kD ，等电 点约为5.28，信号肽是前22 个氨基酸残基，395-416 是预测的活性位点，410 位的 Lys 是预测的P1 位点。 2 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3 基因的原核表达 将Bmserpin-3 的编码区克隆到表达载体pET-28a + ，转化大肠杆菌BL21 感受态 细胞，经 0.5 mmol/L IPTG 诱导进行原核表达。SDS电泳分析表明，转化了 serpin-3 重组载体的BL21 菌，在约49 kD 位置出现了特异性条带，而对照组BL21 菌、空pET-28a + 转化的BL21 菌、非诱导转化去信号肽的pET-28a-Bmserpin-3 重组 菌与诱导转化去信号肽的 pET-28a-Bmserpin-3 重组菌在同一位置则没有出现此特异 条带，说明Bmserpin-3 在大肠杆菌中得到表达，并对其进行了纯化。 3 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3 参与黑化作用 家蚕serpin-3 与果蝇、烟草天蛾、冈比亚按蚊参与黑化作用的serpin 序列比对， 发现它们的同源性很高。用LPS 诱导后不同时间分别测定serpin-3 的蛋白浓度和PO 活性，发现其浓度在LPS 处理后较对照有所增加，PO 活性升高，而在添加Bmserpin-3 I 中文摘要 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3 及相互作用蛋白研究 后，PO 活性则有所降低，且随着添加Bmserpin-3 剂量的增加，其PO 活性受抑制更 明显，说明Bmserpin-3 抑制黑化作用。 4 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3 相互作用蛋白的研究 利用透析纯化技术将获得的原核表达重组融合蛋白进行纯化，经 SDS检 测，纯化蛋白分子量大小与预测的一致，且目的蛋白纯度很高，以此蛋白作为诱饵蛋 白，用His pull-down 方法筛选了与家蚕血液中serpin-3 相互作用的蛋白，经质谱分析， 相互作用蛋白为家蚕储存蛋白 （silkworm storage protein ），性别特异储存蛋白 2 （sex-specific storage-protein 2 precursor ），主要参与免疫，细胞凋亡等。 5 家蚕serpin-3 靶标蛋白的研究 设计3 对siRNA 片段，转染家蚕卵巢细胞BmN ，筛选获得干扰效果显著的片段。 并将有效片段转染家蚕五龄第三天幼虫后用荧光定量PCR 方法检测Bmsp2，3 的表达 量。结果显示，经Bmserpin-3 干扰后，Bmsp2 表达量显著下降，而Bmsp3 表达量有 所下降但不显著。推测Bmserpin-3 或许能通过降低Bmsp2 的mRNA 水平从而引起sp2 蛋白水平下降，而Bmsp3 在mRNA 的水平变化不大，说明Bmserpin-3 没有影响Bmsp3 的mRNA 水平，可能在转录后翻译及翻译后水平参与了对sp3 蛋白表达的调控。 本文成功克隆了家蚕serpin-3 基因并进行了原核表达，利用纯化的表达蛋白，鉴 定了其相互作用蛋白，研究发现seripin-3 参与免疫黑化反应。 关键词：家蚕；serpin-3 基因；pull-down ；RNAi ；黑化作用 作 者：王明慧 指导老师：许雅香 II The research of serpin-3 from Bombyx mori and the interacting proteins of