PCR实验及结果分析要点.pptVIP

PCR出现假阴性原因分析及解决方案 反应体积的改变： 做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 物理原因： 1.变性温度低，变性时间短； 2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率； 3.延伸时间过短等。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 物理原因引起假阴性解决方案： 1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首次循环，必要时可设为95℃ ，10min，或PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。 2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将退火温度设为45℃ ，然后再逐次提高（以2℃ /次为宜）。 3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸10min。 PCR出现假阴性原因分析及解决方案 靶序列变异： 靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。 解决方案： 根据已知序列重新选择区段设计引物。 PCR技术简介 二.PCR出现假阳性原因： 1.引物设计不合适； 2.靶序列或扩增产物的交叉污染。 （1）整个基因组或大片段的污染； （2）空气中的小片断核酸污染。 PCR出现假阳性原