a型禽流感病毒结构蛋白基因ns1的原核表达及间接elisa方法的建立.pdfVIP

摘 要 禽流感严重威胁着世界的养禽业及人类的健康。许多国家采用多种疫苗来控制 和消灭禽流感。随着疫苗的广泛使用，无法区分野毒感染和疫苗免疫的禽群，干扰 了禽流感的检疫及其流行病学调查，掩盖了禽流感的流行，增加了禽流感的预防难 度。研究表明，禽流感的非结构蛋白NSl在感染早期，就大量存在于病毒感染的细 胞中，但在病毒粒子中却检测不到NSl蛋白。即NSl蛋自在病毒复制的早期就大 量表达，仅出现于病毒感染的细胞内，而且能诱导机体产生针对NSl蛋白的抗体。 这提示我们，NSl蛋白可作为一种鉴别诊断标志，通过检测抗NSl蛋白的抗体来区 分野毒感染和疫苗免疫的禽群，以此作为早期感染的依据。并且NSl蛋白作为A 型流感病毒的非结构蛋白，具有高度的保守性，在临床应用中作为鉴别诊断免疫禽 和自然感染禽的检测抗原具有广阔前景。 Influenza 本试验根据GeneBank公开发表的禽流感病毒(AvianVmm，AIV)序 列设计引物，用PCR方法扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白NSI的 基因，并将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中，获得了重组表达质粒 基因。经定位分析，目的蛋白以包涵体的形式存在。通过改变皿TG的浓度和诱导 时间，确定了表达基因的最佳诱导条件：ⅡTG终浓度为0．7mmol／L，诱导时间为 特异性反应，分离表达产物经His·bind柱子纯化后获得纯度较高的NSl蛋白。以 此作为诊断抗原包被酶标板，建立了检测AIV抗体的间接ELISA方法。最佳包被 浓度为1．5／”g／mL，血清的最佳稀释倍数为1：40，酶标二抗的最佳工作稀释度为1： 2000。特异性试验表明：重组NSl蛋白除不与灭活疫苗免疫的禽血清反应外，也不 与NDV，IBV，IBDV，EDSV感染的血清发生反应，具有良好的特异性。 NSl蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫禽群，可作为一种鉴别诊断标 记。NSl--ELISA方法的初步应用，不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴 别诊断方法，为进一步组装成试剂盒奠定了基础，也为禽流感的早期诊断、适时监 控和净化提供了行之有效的方法。 关键词：禽流感病毒；非结构蛋白；克隆；原核表达；间接ELISA The ofAIVNSlGene ProkaryoticExpression forNSl andtheEstablishmentofIndirectELISA Protein Abstract Avianinfluenzaisseriously thebirdcultivationoftheworldandthe threatening VIRUS human with toavianinfluenza gradual research，the health．Along penetrating have theresearchfromstructuraltothenoastructural peoplechanged aspect protein is has thatthereiscertain theNSl research．Itdiscovered protein，whichprotein connectionbetweentheNSl ofavianinfluenzavirusand whichis prot