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动物冠状病毒的检测及应用研究 研究生：吕彩云 导师：胡永浩 摘要 冠状病毒独特的先导引物转录机制，导致了冠状病毒抗原变异株层 出不穷以及具有很高的重组率，这都给动物冠状病毒的检测与防制带来了很大的 困难。因此，建立有效的动物冠状病毒检测方法，对有效控制动物冠状病毒的流 行非常重要。 参考GenBank中公布的冠状病毒相关序列，根据动物冠状病毒聚合酶基因的 保守区段设计一对通用引物，建立一种动物冠状病毒通用PcR方法。用这种方法 可以检测是否为冠状病毒感染，而且不同群的冠状病毒都可以用这一对引物进行 简洁、快速地渗断。特异性试验表明将ccV、FcV等冠状病毒用通用PcR方法均 扩增出449bp目的条带，而阴性对照没有。敏感性试验表明，其敏感程度同于常 规PcR方法。通过克隆测序将不同病毒的聚合酶基因与相应病毒的不同毒株 BLAST，同源性为96％～99％，表明通用引物用于扩增冠状病毒的正确性。将扩增 的聚合酶基因与冠状病毒的参考毒株进行同源性比对结果在56．69％～99．55％之 献中对冠状病毒根据血清学与基因学角度分类报道的一致。 在基因芯片研制成功的基础上，对不同动物冠状病毒进行动物回归试验，将 攻毒的组织样品利用多重PCR扩增以Cy3为标记物与基因芯片上多个基因克隆进 行杂交，同时将基因芯片检测的结果与RT—PcR、病原组织分离鉴定的结果进行 比较，实验结果表明，对于RT—PcR和病原组织分离鉴定为阴性的样品基因芯片 检测呈阳性，而且可以得出RT—PcR检测比病原组织分离鉴定更灵敏。因此，从 基因芯片应用的角度用实验证实基因芯片技术检测动物冠状病毒比其他的方法 更灵敏、更准确。 根据NCBI中公布犬冠状病毒Tn449株的基因序列，通过RT—PCR扩增出S 基因890bp的片段，克隆测序并与参考毒株进行同源性比较和进化树分析，结果 表明CCv 株，核苷酸与氨基酸同源性分别为35．8％、28．4％。与其它参考毒株核苷酸同源 性在96．O％～87．3％之间，氨基酸同源性在96．6％～91．2％之间。同时构建了 DET32a—CCv—S表达质粒，为进一步利用重组S蛋白对犬冠状病毒功能的研究以 及感染的诊断奠定基础。 关键词：动物冠状病毒；聚合酶基因；通用聚合酶链反应；基因芯片；纤突 蛋白 Detectionand Application Study on AnimalCoronavirus Lv Cai_yun Postgraduate： Pro￡Hu Supervjsor： Y0ng-hao AbstractThe leader mechanismofCorona“rusIeadsto specj行c prime transcription hi曲 va“ationof and rateof antigenhigh recombination．Itmassjvedifncultiesfor and b“ngs diagnosis controlofCoronavirus．Theestablishmentofe矗色ctjvedetectionofanimal method Coronavirusjs