动物源性大肠杆对氨基糖苷类药物耐药及其相关机制的研究.pdf

动物源性大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药及其相关机制的研究 {I萄姜 氨基糖苷类抗生素是一类高效广谱的抗生素，由于在I临床上得到了广泛应用， 细菌对其产生的耐药现象日益严重，导致该类抗生素在治疗中的作用受到了限制，但 它的化学结构，活性，药动力学等方面的研究已成熟，半合成的氨基糖苷类抗生素难 以在结构上有所改变，所以了解细菌的嗣药机制已是刻不容缓。 本研究主要经最低抻菌(MIC)测定从临床分离的15株大肠杆菌中筛选2株高 度耐药株，4株中度耐药株，1株低程度耐药株，从不同的角度对这7株耐药菌耐药 机制进行研究，以期对氨基糖苷类抗生素耐药性的监测、控制作出有益的探索。 首先选取钝化氨基糖苷类药物三种酶的五种基因卯c(6’)一Ib，叩c(3)．IV，伽姐， 掣向A，印向(2”)对7株耐药菌进行PcR扩增，这几种基因所编码的钝化酶在大肠杆 菌中较为常见，但仅有嘶A基因扩增成功，所以初步断定引起这几株菌对氨基糖苷 类抗生素耐药的主要机制是础A编码的磷酸转移酶的作用。 进行定量检测，方法主要是设计参比引物构建表达载体，提取大肠杆菌的RNA，并 反转录，利用所设计的检测引物进行实时荧光定量RT．PCR。结果得出不同耐药强度 的大肠杆菌印矗A基因mRNA表达水平存在着差异，二者呈正相关，并且通过耐药性 和表达水平的差异，推断出这7株菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要机制是印矗A基 因产生的磷酸转移酶的钝化作用。 法是将神A基因克隆表达，将表达后的蛋白作为抗体免疫动物，制备抗体血清，通 测，得出耐药强度同大肠杆菌础A基因蛋白表达水平成正相关，结论与上述方法相 一致。 通过上述结果的进一步分析4株中度耐药菌的耐药强度相当，所检测到表达水平 也相当，所以引起它们的主要耐药机制就是印知A基因编码钝化酶的作用。高度耐药 的两株菌在检测中咖A基因的表达有差异，但它们的耐药强度相当，所以还应有其 他的耐药机制存在。为了能更深入了解两株高度耐药菌(7、5号)的差异所在，本实验 选取了编码16srRNA基因，坶A和核糖体蛋白基因邵L，将其克隆到pGEM—TEasy Ⅲ 载体上，观察这两个基因编码的核糖体突变情况，其中7号菌的枷A基因的表达水 平较低，其ⅣsA基因发生了突变，5号菌未发生突变，而聊L基吲均未见突变。由 此可见引起7号菌对氨基糖苷类药物耐药是由，A，a砌A共同介导的。， 本实验在分子生物学水平上，从不同角度分析了临床分离的大肠杆菌对氨基糖苷 类药物耐药的主要机制，这将为耐药性的检测和控制提供了科学依据，在临床治疗中 具有一定的理论意义。 关键词：氨基糖苷类抗生素，印疔A基因，耐药菌，表达，核糖体突变 M01ecularMechanism ResistaIlce in西幽eri幽胁co，j ofAminoglycos试e Isolated疗omA』limals Abstract an矗bioticsarcakind Aminoglycosidc Becauseof ofhighpcrfbrmance卸dbroad-specnⅥm drugs atlIibioⅡcsareinuse widely，the of resist锄ceinbaderiabecomemoreseriousmall phenomenondnlg leadtotlleuseoftlloseamibi舐csin beforc，wmch weresllfrercdlimiIed llleresearch