区分禽流感野毒染鸡群与免疫鸡群的鉴别诊断方法研究.pdf

区分禽流感免疫鸡群与野毒感染鸡群鉴别诊断方法的研究 摘要 禽流感(灿)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1878年意大 利首先发现至今，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行。目前，高致病 性禽流感(HP越)已被国际兽疫局规定为A类动物传染病。近年来，禽流感在我国 开始流行，特别是2003．2004年初高致病性禽流感在我国和部分亚洲国家爆发流行， 不仅造成了养禽业的巨大经济损失，而且导致人类的感染和死亡，引起了世界各国 政府和普通民众的高度重视。其防制已直接关系到养禽业的持续稳定发展和人民的 身体健康。虽然我国许多养鸡场使用禽流感灭活苗，在一定程度上控制了禽流感的 流行，然而如何区分免疫鸡群与感染鸡群却成为当前面临的一大难题。现有研究表 明，非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染机体的一个重要标记。禽流感感染鸡体 内产生禽流感病毒结构蛋白抗体和非结构蛋白抗体，而免疫鸡体内主要产生结构蛋 白抗体，利用这种抗体差异，可用非结构蛋白区分免疫鸡群与野毒感染鸡群。因此， 本研究基于该背景着眼于利用禽流感病毒非结构蛋白NSl基因，建立可区分免疫鸡 群与野毒感染鸡群的快速鉴别诊断方法，为养禽业的稳定发展和人类健康，为最终 控制和消灭这种疾病提供可靠依据和技术保证。主要工作包括： 1． AIV NSl基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 根据禽流感病毒非结构蛋白(NSl)基因的序列，设计了1对针对NSl基因的 特异性引物，从本室分离的毒株中扩增了H9N2亚型流感病毒的NSl基因。扩增的 定和序列测定后，进一步将其插入pET．28a中，构建了原核表达载体pET．28a．NSl， 其在E．coli 为30KD。斑点杂交及Westernblot印迹分析证实表达产物具有抗原性。 2． NSl．ELISA的建立 将经纯化、变性、复性等处理后的NSl蛋白作为抗原，建立禽流感的NSl一ELISA 佳血清稀释浓度。采集经禽流感(H9N2)亚型灭活苗免疫，经HI检$b阳性的 份鸡血清，进行NSl．ELISA检测全为阴性，计算该94份血清的平均值f，计算得Z 鸡血清，结果表明，该方法诊断特异性为93．1％，诊断敏感性为94．4％。取6份抗体 水平不同的血清样品在同一批试验中每份样品平行作6次(批内)，又在6个不同试 验日重复测定6份样品(批间)，结果批内，批间重复的吸收变异系数均小于10％。 说明此方法重复性好。以NSl一ELISA分别检测鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性 支气管炎、鸡传染性喉气管炎、鸡传染性法氏囊、鸡腺病毒I型、鸡腺病毒III型、 鸡副流感的阳性血清，进行特异性试验的8份血清，检测全部为阴性，表明该方法 区分禽流感免疫鸡群与野毒感染鸡群鉴别诊断方法的研究 的分析特异性好。以上结果表明NSl，ELISA特异、敏感且重复性好，可用于区分禽 流感灭活苗免疫鸡与自然感染鸡。 3．禽流感病毒NSI．EUSA鉴别诊断试剂盒的组装与应用 将本研究建立的禽流感病毒NSl一ELISA快速检测方法组装成诊断试剂盒。试剂 盒由1．7号试剂、两块ELISA板和一份说明书组成。对试剂盒内各组份进行了特异 性、敏感性、重复性及仍在进行的保存期的测定。结果表明，试剂盒特异性强、敏 感性高、重复性好，目前在一20℃下保存4个月仍然稳定，而且操作简单、方便。 迄今为止己在湖北、深圳、河南等地共检测样品783份，试验结果显示，利用禽流 感病毒非结构蛋白NSl基因表达抗原，建立的ELISA检测方法可以快速、准确地区 分禽流感免疫鸡与野毒感染鸡。该方法的建立为我国控制并最终扑灭禽流感提供了 有力的技术支持。 关键词：禽流感病毒；NSl基因；表达；酶联免疫吸附试验：鉴别诊断。 区分禽流感免疫鸡群与野毒感染鸡群鉴别诊断方法的研究 Abstract Avian oneoffatalinfectiousdisease Influenza(AI)iS causedinfluenzaAvirusin by avian．Itwasfirst in in strains