区别伪狂犬病病株和疫苗株的荧光实时定量pcr方法的建立.pdf

摘 要 伪狂犬病病毒是严重影响养猪业发展的重要病毒，该病毒粒子具有较强的抵 抗力。gE基因是伪狂犬病病毒的毒力基因和基因缺失疫苗的缺失基因。本实验 在伪狂犬病病毒西和gB基因区域内分别设计两对引物，和一条gE荧光探针， 利用荧光定量PCR原理，结合PE7700检测系统，首次建立了定量和鉴别检测伪 PCR 狂犬病毒野毒株与疫苗株的荧光定量PCR方法。结果表明gE-MGBTaqman 灵敏度达101拷贝数量级，线性范围为lO 7．101copies／reaction，达7个数量级。其 PCR greenPCR和普通PCR。应用gE-MOB—Taqman 灵敏度显著高于gBSYBR 检测18份冰冻组织样品，阳性率为15／16(除2份弃去)，与血清中和结合细胞 MTT比色试验结果比较，符合率为100％。此方法咀闭管的模式操作，减少了以 后步骤污染的可能性，整个PCR检测过程少于2个小时。 关键词：伪狂犬病病毒 PCR gE基因荧光实时定量PCRTaqman SYBRPCR green 前 言 伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRY)是除人类及无尾猿外所有哺乳动物均 可感染的一种疱疹病毒Il】，所引起的伪狂犬病在全世界广泛流行，症状以发热， 奇痒和脑脊髓炎及母猪流产为特征，对牛和仔猪的死亡率可达80％-100％，给养 殖业带来了巨大的经济损失，猪为该病毒的储存宿主。 该病毒一旦感染动物则可能终生带毒呈潜伏状态，遇到外界应激则重新激活 而向外界排毒，引起易感动物发病，欧美国家的伪狂犬病的感染率在7％以上， 泰国阳性猪场曾高于61．9％；目前伪狂犬病所导致的经济损失仅次于口蹄疫【2叫。 在我国，情况与国外相似。到目前为止，已有20个省市报道过本病。1987．1989 D】；1998年应用血清学方法对四川省6个 年四川省的调查中，阳性率为21．8％[1 地区的调查，阳性率为34．53％【“l。1988-1994年广东省先后有36个场报道过本 病，占全省大型养殖场的30蚶屹】；华中地区的猪场阳性率为88％，血清学检查 的阳性率为48．4％，PCR阳性率为75％【13】。2000年1．3月陕西省伪狂犬病的疫 -伪狂犬病是世界动物卫生组织(OIE)和我国农业部公布的二类传染病，在 我国对外缔结的猪类的相关动物和产品的官方兽医检疫协议中均为必须检疫的 疾病，在我国输俄肉类产品出具的兽医卫生证书上也有明确的要求。作好伪狂犬 病病毒的检测工作，对于防止PRV传入传出国境，保护我国养殖业，履行我国 对国际的义务，维护检验检疫系统的信义都具有重要的意义。 为控制PRV的蔓延，世界各国研制了多种疫苗，特别是基因缺失疫苗出现 后，PRV的防制工作有了根本性变革，为根除PRV带来可能。基因缺失疫苗由 于特征性地缺失一段DNA，使得它在分子生物学和免疫学上具有区分野毒的“标 志”，又称为标志性疫苗(MarkerVaccine)，与一定的检测方法结合，便能用免 疫接种和扑杀阳性动物相结合的方法来根除PRV。目前，OIE推荐使用基因缺失 疫苗，我国农业部已决定只生产和使用基因缺失疫苗。目前商业化基因缺失疫苗 普遍缺失了gE基因，甚至立法规定只允许gE(gI)基因缺失疫苗使用。基因缺失 疫苗的广泛使用，迫切需要高灵敏度的检测方法与之配套。 目前，对PRV检测的方法主要为病毒分离鉴定，琼脂扩散试验，微量血清 中和试验(见《中华人民共和国出入境动物检疫规程》)，gE—ELISA，PCR等方法。 病毒分离需要很长的时间，而且仍然需要苏木紫一伊红染色检测嗜酸性核内 包涵体，电子显微镜等实验进行最后鉴定。 琼脂扩散试验利用全血清