口蹄疫病毒rtpcr与抗体elisa检测方法的建立及初步应用.pdf

摘要 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起如黄牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物感染的一种热性、接触 性、烈性传染病，被国际动物卫生组织列为A类重要传染病之首。该病的发生和流行严重危 害畜牧业的健康持续发展，造成巨大的经济损失，因此世界各国相当重视对该病的研究和防 制。本研究主要分为三部分，即建立了FMDV的RT-PCR检测及血清型鉴定的方法：V】)2 基因在大肠杆菌和杆状病毒2种表达系统中进行了正确表达，将原核表达的VP2蛋白纯化后 作为抗原，建立了FMDV VF2蛋白抗体间接ELISA检测方法：以原核表达纯化的3ABC蛋 白为抗原，建立了非结构蛋白抗体间接ELISA检测方法，旨在鉴别诊断自然感染FMDV和 疫苗免疫的牛。 克隆得到目的片段进行测序，比较同源性而确定血清型。通过敏感性试验检测，2对引物均 可以检测到IOTCIDso的病毒量；特异性试验的检测，2对引物的对正常细胞，牛黏膜病病毒、 猪瘟病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性．利用该方法对病 牛的流涎液体、水疱液体、舌皮组织、感染犊牛心脏等组织进行检测，初步结果显示：该检 测方法可以对。型和AsiaI型FMDV进行特异性检测。 HTb和杆状病毒转移载体 第二部分，将VP2基因分别克隆到原核表达载体pPROEXTM 将重组的转移载体质粒pBL-VP2，转染昆虫细胞sf9，经4轮噬斑筛选后，将纯化的重组病 毒接种于sf9细胞，72h后收集细胞进行SDS分析、Western 定。所有结果证实：VP2基因在杆状病毒表达系统中获得了正确表达。将重组质粒pPR-VP2 转化到大肠杆菌感受态DH5ct中，经终浓度lmmol／LIPTG诱导，在4h时VP2蛋白获得展大 表达量。利用Ni-NTA蛋白质纯化系统对VP2蛋白进行纯化，并通过Western blotting和 Dot-ELISA方法进行鉴定，证实VP2蛋白在原核表达系统中获得正确表达，并得到了纯化的 VP2蛋白。最后，以纯化的VP2蛋白为抗原，建立VP2蛋白抗体间接ELISA检测方法，通 过对各个反应条件的优化，最终确定了最佳反应条件。 第三部分，将3ABC基因克隆到原核表达载体pGEX-6p—l，利用酶切和PCR鉴定，成功 在原核表达系统中获得正确表达，并得到了纯化的3ABC蛋白。最后，以纯化的3ABC蛋白 为抗原，建立FMDV非结构蛋白3ABC抗体问接ELISA检测方法，并对各个反应条件进行 了优化，确定了自然感染动物和疫苗免疫动物的i临界值为O．376。对18份血清检测结果为： 7份阳性血清中有1份的结果略低于临界值，免疫牛血清和阴性血清检测结果均低于I临界值， 可以初步证明该方法可应用于自然感染FMDV动物和疫苗免疫动物的鉴别诊断． 关键词：FMDV；RT-PCR；VP2基因；3ABC基因；问接ELISA； The Establishmentand for Primary RT-PCR Application DetectionofFMDV andELISAofTheir Assay Assay Antibodies Abs仃act Foot-and—mouthdisease causedfoot-and-diseasevirusisa disease by among highlycontagious clovenhoofedanimalsandwasli