大肠杆菌（e.oli）flt;,41gt;黏附素基因原核表达及鸡抗flt;,41gt;菌毛蛋白卵黄抗体的制备.pdfVIP

摘要 1．大肠杆菌F4I黏附素基因的原核表达 仔猪腹泻主要是由产肠毒素性大肠杆菌引起的一种传染病。本研究以F4l黏附素蛋白为主 要研究对象，应用分子生物学手段，表达了F4，黏附素蛋白。 (1)F4。黏附素基因的序列分析 参照文献报道，设计合成了一对特异的带特定酶切位点的引物，以提取的F4l基因组 DNA为模板，用PCR的方法成功扩增出F4I黏附素基因，并进行序列测定。结果表明：所测 核苷酸同源性为100％。 (2)F4．黏附素基因的表达 纯化的PCR产物经克隆位点双酶切后与经同样位点双酶切的原核融合表达载体pET-28a 5h，目的蛋自能获得高效表达，目的蛋白大小为31．5kDa。 2．大肠杆菌F．I菌毛蛋白的提取及ELISA检测方法的建立 (1)本实验采用热振荡的方法提取产肠毒素性大肠杆菌F41的菌毛蛋白，用紫外分光光度计检 测所提取的菌毛的浓度，根据公式计算可得所提取的莹毛蛋白的浓度是1．19mg／mL；SDS． PAGE检测所提取的菌毛蛋白的纯度和分子量．胶图显示为一条清晰的条带，大小为29，5kDa， 表明所提取的菌毛蛋白没有杂蛋白。 (2)用棋盘滴定法确定间接ELISA检测卵黄抗体效价的最适反应浓度，确定了抗原最佳包被 浓度是149pg／mL，阴性血清