宣木瓜细胞培养其活性物质的研究.pdfVIP

摘要 本研究以宣木瓜不同部位的组织作为实验材料，对其进行组织和细胞培养，目的 是诱导出宣木瓜生长旺盛、 结构疏松的愈伤组织， 从而建立宣木瓜细胞悬浮培养体系， 对其次生代谢的合成进行调控。 系统地研究了宣木瓜愈伤组织的诱导条件和疏松愈伤 的调控方法以及悬浮培养体系细胞的特点和生长规律等。 使用分光光度法测量宣木瓜 中齐墩果酸的含量变化，为工厂化生产齐墩果酸提供理论依据。 在宣木瓜愈伤组织诱导阶段，比较了不同外植体来源、不同灭菌时间配比、不同 的光照条件对宣木瓜愈伤组织诱导率、褐变情况以及生长状态的影响。在诱导培养基  ­1  ­1  MS+2,4­D(1mg∙mL  ) +KT (0.1mg∙mL  )进行诱导培养，幼嫩的茎段以及叶片最容易诱 导出愈伤组织。将其作为材料，进行消毒时间的比较，得出叶片的最佳消毒时间为：  75%酒精 5s 和 0.1%的升汞 5min，茎段的最佳消毒时间为：75%酒精 5s 和 0.1%的升 汞 10min。诱导时弱光照条件更有利于宣木瓜愈伤组织的诱导。 在宣木瓜愈伤组织继代培养阶段， 需要调节愈伤组织的状态， 从而获得结构疏松、 生长旺盛的愈伤组织，为细胞的悬浮培养提供材料。结果表明在最佳继代培养配方：  ­1  ­1  ­1  MS+2,4­D(1mg∙mL  ) +KT (0.5mg∙mL  )上进行继代培养，最适合的糖浓度为 30g∙L  ， 最佳的 pH 为 5.5~6.0，对于宣木瓜细胞继代培养的时间，20d左右为最佳继代时间。 比较了光照条件对愈伤组织生长的影响，同时绘制了在 30 天内的动态生长曲线。愈 伤组织在这个培养阶段中都呈现出“S”型生长曲线，但是光照条件明显有利于细胞的 生长，但是在后期褐变较严重。 建立宣木瓜细胞悬浮培养体系，研究了不同的接种量、碳源的种类及其浓度、培 养过程中 pH 的变化等因素对细胞悬浮培养体系的影响，同时还测定了悬浮培养过程 中细胞的动态生长曲线以及活性物质的含量。结果表明：以MS为基本培养基不加琼 ­1  脂，配制成液体培养基，最适合的接种量为 4g∙flask  ，最有利于细胞生长的碳源是麦 芽糖，但是活性物质产量最高的为蔗糖，因此选择蔗糖为宣木瓜悬浮培养的碳源。最 ­1  ­1  合适的碳源浓度为 20g∙L  ，活性物质的产量达到了 0.5g∙L  。最适合细胞生长的 pH  ­1  为 5.5，此时细胞的活性物质产量也达到了最大，为 0.42g∙L  。通过二步培养法对宣 木瓜进行悬浮培养，通过比较，得出在悬浮培养后 5d 更换新鲜的培养液可以有效地 加快细胞的生长速度以及活性物质的积累。 比较不同MS培养基浓度对悬浮培养的影 响发现，MS是最佳的培养液浓度，光照对悬浮细胞的生长有明显的促进作用。建立 悬浮生长曲线，同时测定培养过程中细胞生长、pH 以及活性物质积累的变化。以30d  为测定周期，细胞的生长在 0~9d 为生长迟滞期，在 9~15d 为快速生长期，此后细胞 的生长逐渐减慢。悬浮液的 pH 在培养周期中先降低，后升高，再降低。用分光光度 I  法，对前面获得的细胞中齐墩果酸的含量进行，发现在 27d 时细胞中的活性物质的含 量及其产量都达到了最大值。 关键词：宣木瓜 愈伤组织 诱导 继代 悬浮 活性物质 齐墩果酸 II  Abstract  Tissue and cell culture were used in this study. Different parts of the Chaenomeles  speciosa org