《蛋白电泳技术手册》.pdf

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ）技术手册 蛋白免疫印迹杂交 （Western Blot WB ）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂 交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行蛋白质分析最流行和 成熟的技术之一。本指南讨论 Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成 WB 。 A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备 B 电泳 1 PAGE 胶的制备 2 蛋白分子量 Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳 C 转膜与显色（Western Blot ） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色 D 常见问题分析与解决方案 附录 1 WB 实验试剂配制方法 附录2 SDS胶的配制 WB 概述: 检测原理: 2 A 蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是 Western Blotting的第一步，更是决定 WB成败的关键步骤， 总体原则和注意事项： 1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品） 2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择） 3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解 裂解液 Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位 推荐裂解液 Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞 NP-40 or RIPA （附录1） 全蛋白抽提试剂盒 细胞质（可溶蛋白） Tris-HCl （附录1） 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质（细胞骨架等不溶蛋白） Tris-Triton （附录1） 蛋白分级抽提试剂盒 细胞质（磷酸化蛋白） 磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜 NP-40 or RIPA （附录1） 膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 细胞核 RIPA （附录1） 核蛋白抽提试剂盒 线粒体 RIPA （附录1） 线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒 细胞裂解操作方法： 1 培养的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节 2） 7 2 6 2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 10 cells/100mm dish/150cm flask; 0.5ml per 5x10 cells/60mm dish/75cm2 flask). 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及