PKA信号通路在脑缺血后突触可塑性中的作用及针刺干预研究《广州中医药大学》2009年博士论文.docVIP

PKA信号通路在脑缺血后突触可塑性中的作用及针刺干预研究--《广州中医药大学》2009年博士论文 在当今社会,脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一,其中缺血性脑血管病疾病占60%～80%,由于神经元能量储备极少,对缺血缺氧十分敏感,缺血性神经元死亡是脑血管病致残和致死的重要因素,因此,探讨缺血性神经元损伤的机制及其防治具有重大的理论和现实意义。关于其机理研究方面近几年脑可塑性尤其突触可塑性成为了研究重点,对针刺促进脑血管病的恢复机制研究提供了很多依据。PKA系统可以作用于突触可塑性,增加递质释放持续增多以及调节突触结构的变化,参与“慢突触传递”,因此本课题通过观察电针对脑缺血大鼠及其注射H89后突触结构可塑性及相关物质的变化来探讨PKA信号通路在脑缺血中的可能机制及针刺对其的影响。本文从以下几个方面进行了研究。 1.文献研究 本部分就古代中医学关于中风的命名,缺血中风的病因病机,中风与五脏六腑的关系以及针灸治疗中风的古代记述方面进行了论述,从而对中风的古文献研究背景有了深入的认识。近年来在脑血管病的研究中发现卒中后恢复的不同阶段,大脑功能和组织结构可以发生一定的自我修复和重建能力,其中突触可塑性是大脑可塑性的主要表现形式,本文就近几年缺血后突触可塑性以及针刺干预作用的研究进行了综述,为进一步研究针刺治疗脑缺血的机制奠定了理论基础。 2.实验研究 目的:本研究观察了脑缺血及注射H89后不同时间段的学习记忆能力、突触超微结构的变化,生长相关蛋白GAP-43、突触素P38表达的动态变化,并探讨针刺督脉“百会”“大椎”干预其变化的时效关系为临床针刺治疗缺血性脑血管疾病提供坚实的理论基础。 方法: (1)本实验选用250只Wistar大鼠分为假手术组、缺血组、缺血+电针组、缺血+H89组、缺血+H89+电针组共五组,各组再按距离手术结束时间的不同再分为1h组、3h组、6h组、12h组、2周组5个时间段小组进行观察。动物模型延用以往的电凝闭大脑中动脉法,造成局灶性脑缺血模型。其中假手术组只作手术暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭;缺血组采用电凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型:缺血+H89组造模后侧脑室给予H89药物注射;缺血+电针组、缺血+H89+电针组造模并药物注射后立即给予电针治疗,选取督脉经穴百会(GV20)、大椎(GV14)两穴进行针刺,针刺后接电针30min。 (2)Y迷宫学习记忆功能的观察:应用Y迷宫观察各组大鼠空间辨别的学习记忆能力,于手术或治疗后第3h、6h、12h和2周进行试验,数值越高代表分辨学习的能力越差。 (3)突触的超微结构:12h、2周后,随机取10小组大鼠每组各3只左心室灌注取材,参数的观察采用JEM-1200EX透射电镜,底片放大1.5万倍印相,进行电镜观察缺血区大脑皮层突触界面参数PSD、间隙宽度和界面曲率的变化规律及电针对其的影响。 (4)生长相关蛋白GAP-43的表达变化:150只大鼠于术后1h、3h、6h、12h和2周每个时间段分别左心室灌注取材后,采用免疫组化方法检测生长相关蛋白GAP-43的表达并观察其变化。 (5)突触素P38表达变化:150只大鼠于术后1h、3h、6h、12h、2周组5个时间段分别左心室灌注取材后,采用免疫组化的方法检测突触素P38的表达并观察其变化。 结果: (1)Y迷宫学习记忆功能 缺血组学习成绩从3h开始始终差于假手术组,脑缺血后6h至2周,大鼠的学习记忆能力逐渐有所提高;缺血+针刺组大鼠Y迷宫测试成绩始终优于缺血组,且至2周学习成绩与假手术组无明显差异(P＞0.05),缺血+H89组的学习成绩较缺血组为差;缺血+H89+针刺组优于缺血+H89组。 (2)突触界面参数 脑缺血后,大鼠的PSD厚度下降,注射H89后下降更明显,与假手术组比较均有显著差异(P＜0.001);电针治疗后12h、2周,PSD厚度改善明显,缺血+H89+针刺组明显高于缺血+H89组,并且高于缺血组。 12h、2周脑缺血后间隙宽度变窄,在注射H89后,突触间隙宽度变小最明显,经电针治疗后,缺血组及注射H89后的大鼠间隙宽度均增加,电针可以促进突触间隙恢复正常。 脑缺血损伤12h、2周,突触界面曲率减小,减少了神经元的接触面,大大降低了神经信息传递的有效性,注射H89后,突触界面曲率下降更明显,电针治疗后界面曲率增加明显,缺血+H89+针刺组明显高于缺血+H89组,并且也高于缺血组。 (3)生长相关蛋白GAP-43的表达 假手术组GAP-43的表达较低,缺血组3h、6h、12h、2周GAP-43的表达均较假手术组增强,于12h升高最明显;缺血+针刺组GAP-43于五个时间段表达大大高于缺血组;缺血+H89组给予PKA通路抑制剂H89后,3小时开始GAP