dnd1与gr相互作用的鉴定.pdfVIP

摘要 背景： Dndl基因在小鼠雄性生殖细胞发生和睾丸生殖细胞瘤发生中有 重要作用，但其作用机制及其与人类疾病关系仍未明了。在前期工作 中，我们己通过酵母双杂交技术筛选到四个与人DNDl相互作用的 蛋白，它们分别是GRN、FLADl、RNF3 因在调节细胞生长、损伤修复和肿瘤的发生中起重要作用。由于酵母 双杂交系统的筛选存在假阳性结果，为此我们利用免疫共沉淀、GST 们可通过验证Gm和Dndl的相互作用，来找出它们之间的联系，为 进一步阐明Dndl的生物学功能奠定基础。 实验目的： 验证DNDl与GRN的相互作用。 实验方法： 片段，通过酶切与连接，将Grn片段构建到原核表达载体pGEX一4T-2 0，菌液 和真核表达载体pemGFP．C1上，再转化入感受态细胞TOPl PCR鉴定阳性克隆并测序分析；(3)通过细胞内共定位的方法，确定 GRN与DNDl在细胞内相互作用的亚细胞位置；(4)利用免疫共沉淀 技术，验证DNDl与GRN真核表达产物细胞内是否具有相互作用； (5)利用GST 1原核表达产物细胞 pull．down技术，验证GRN与DND 外是否具有相互作用。 实验结果： (1)成功构建人Dndl原核表达和真核表达的重组载体： T 万方数据 胞质中有明显的共定位；(4)免疫共沉淀试验证实DNDl与GRN在真 核细胞内具有相互作用；(5)GST GRN在体外具有相互作用。 实验结论： 利用细胞内共定位实验、免疫共沉淀和GST pull—down试验证实 通路及其生物学功能奠定基础。 关键词：人Dndl基因：人Gm基因；基因克隆；共定位；免疫共沉 淀；GST pull—down。 万方数据 1 an roleinthe Background：DlIldgeneplaysimportant development andtesticularcell its ofmalemouse cells tumors，but reproductive germ arestill ofactionandits withhumandiseases mechanism relationship unknown．In havescreenedoutforDND1 work，we interacting previous two are GRN，FLAD1，RNF31， proteinbyyeast hybridtechnique，they EFEMP1．TheGm an roleinthe ofcell geneplaysimpor