bmp7通过bpr1a、bmpr1b抑制肺大细胞癌nci-h460细胞的增殖.pdfVIP

·中文论著摘要· NCI．H460细胞的增殖 刖 舌 BMP7(Bone Protein，骨形成蛋白7)是BMP家族成员之一， Morphogenetic 其的主要功能是在胚胎发育中参与调节各胚层细胞的增值、分化、迁移等生理过 程以及在出生以后参与骨骼的发育和诱导异位骨形成。近年的研究发现它在肿瘤 发生发展中也发挥了重要作用。AlarmoEL等在三个高表达BMP7(BT0474、 源性加药两种途径研究了BMP7对乳腺癌细胞增殖的影响。结果发现，虽然内源 增殖的作用，但是它们促进细胞增殖的机制却完全不同。内源性BMP7是通过促 进细胞由G1期细胞进入S期来促进细胞的增殖，而外源性BMP7则是通过抑制 细胞凋亡来促进细胞的增殖。更有趣的是，在五个不表达或低表达BMP7的细胞 以通过多种途径影响肿瘤细胞的增殖。BMPs受体分为I型和II型，其中I型受 亚型，但是这三种亚型在信号传递过程中的作用机制目前尚未明确。我们推测， BMP7对肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移侵袭能力的不同影响很有可能与参与BMP7 信号传递的I型受体的类型有关。为了证实这个的推测，我们检测了3种非小细 的表达情况，并分析了其表达水平与肺癌的恶性程度和侵袭转移能力之间的关系。 从中筛择出同时表达三种受体的肿大细胞癌NCI．H460细胞系作为研究对象。随 后，我们检测了外源性hBMP7对肺大细胞肺癌细胞NCI．H460增殖、凋亡、迁移 和侵袭的影响。最后我们在NCI．H460细胞中通过特异性抗体分别阻断不同的1 型受体，研究hBMP7处理后细胞增殖能力的改变，探讨了不同的I型受体在BMP7 信号传导过程中的作用机制。 材料和方法 一、细胞株和试剂 ACVRIA抗体均购自SantaCruz公司；兔多克隆抗人13．actin抗体由北京中杉金 桥生物技术公司分装；山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术公 司；RT．PCR试剂盒购自Takara公司。 二、细胞培养 肺腺癌细胞A549在含10％胎牛血清的DMEM培养液中贴壁生长；人支气管 贴壁生长，均在37℃，5％C02条件下培养。 三、RT．PCR 糖凝胶电泳进行检测，采用凝胶成像分析系统进行半定量分析。 四、SDS．PAGE电泳和WesternBlot 提取细胞总蛋白。电泳、转印，小牛血清封闭后加入相应的一抗、二抗，DAB 显色。结果判定为转印膜上出现灰色条带，并对条带进行狄度值测定。 五、生长曲线测定(MTT) 以103个细胞／孔的密度，将细胞接种十96孔细胞培养板内，霄于细胞培养箱 内培养，每过24h每组各取6孔细胞检测增殖情况。每孔内加入20／．tlMTT溶液， nm处测量各孔的吸光值。 150／ADMSO，在酶联免疫检测仪490 2 六、流式细胞仪检测凋亡 buffer悬浮细胞，使其密度为lxl06／ml左右， 收集细胞，沈涤细胞，用lxbinding 再用AnnexinV标记液轻轻重悬细胞，每105～106细胞100ul孵育液。在暗处，室温 buffer稀释，在15分钟内进行流式检测。 lxbinding 七、细胞迁移和侵袭能力检测 USA)， 上室中加入100／tl无血清RPMI．1640培养基(孔径趴m，Costar， 5％C02孵箱中培养6hr后吸尽培养基，固定染色，镜下观察。 八、统计学分析 应用SPSS+13．0统计分析软件，细胞实验结果采用t检验进行数据分析，用 mean+_SD表示，P0．05为有统计学意义。 结 果 应用RT．PCR和Westernblot方法检测的结果显示BMP7在人J下常支气管上 皮细胞系HBE中表达最多，在两个肺腺癌细胞系A549、LTE中及一个肺大细胞 癌细胞系NCI．H460中表达依次减少。 HBE细胞系中的表达情况 应用RT-PCR和Westernblot方法检测的结果显示BMPRlA在各细胞系中均