5-fu可富集腺癌spc-a1细胞系中肿瘤干细胞.pdf

个人简介…………………………………………………………………………50 ·中文论著摘要· 5-FU可富集肺腺癌SPC-A1 细胞系中肿瘤干细胞 目 的 肺癌是对人类健康危害极大的恶性肿瘤，我国是肺癌发病率较高的地区，尽管 目前我国肺癌的发病率有下降趋势，但其发病率和死亡率仍高居恶性肿瘤首位。 由于肺癌的发病机制不清，尚不能有效地预防其发生，因此探索肺癌发生的相关 机制，寻找特异性的阻断和治疗方法一直是人们努力的方向。 最近，大量实验证实存在少量维持恶性生长的并具备自我更新能力的细胞亚 stem cell，CSC) 群，这群细胞具备较高恶性程度的细胞被称为肿瘤干细胞(cancer 或肿瘤起始细胞．目前已经在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌等多种实体瘤中证 实了CSC的存在．因此，根据此学说推测肺癌也可能来源于干细胞，是一种干细胞 疾病。传统治疗方法虽然可使肿瘤体积明显缩小，有的甚至可达到完全缓解，但 实际上大部分肿瘤经过一段时间的缓解期之后又会复发或转移，这可能是由于现 有的治疗手段没有清除这些决定复发和转移的关键细胞——肿瘤干细胞的缘故。 侧群细胞(Sidepopulation cassette 的一群特殊干细胞．由于其细胞膜表面高表达ABC转运蛋白(ATP-binding membrane 且具备自我更新、多向分化、成瘤性等一系列干细胞的生物学特征。 肺癌细胞对一些化疗药物具有耐药性，且大部分耐药细胞被5-FU阻滞于Go 期，而研究表明，肿瘤干细胞大多处于Go期。因此我们猜想，对5-FU表现出耐 药性的细胞群中是否可能包含了大量的肿瘤干细胞。我们能否利用这一耐药模型 来富集肺癌干细胞?本研究旨在探索5-FU对于肺腺癌细胞系SPC．AI中肿瘤干细 胞的影响。 方 法 1、细胞培养 肺腺癌SPC．A1细胞系购自ATCC。SPC．A1细胞在含有1 0％胎牛血清(GBICO 清(GBICOInc．，NY，USA)中培养(37C，5％C02)。 2、四甲基偶氮哩盐(tetrazolium，MTT)法检测细胞增殖能力 取对数生长期的肺癌细胞悬液进行细胞计数，分别接种于4个96孔板培养板。 接种24小时后加入各种处理因素。处理后第24、48、72、96小时分别加入 孔吸光度。 3、流式细胞仪检测细胞周期 收集对数生长期细胞制成1x106个／ml细胞悬液。75％冷乙醇于4C固定过夜、 离心后制成5001aL的细胞悬液，加碘化丙啶染液于4C避光孵育45分钟后上机检 测，ModFitLT3．0软件分析细胞周期。 4、免疫荧光染色 分钟。1％的BSA常温封闭30分钟。封闭完后加入一抗，4C过夜。次日，加入 相应二抗，室温孵育1个小时后，DAPI染核，荧光显微镜观察。 5、Westemblot 收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量。电泳后将蛋白转印到PVDF膜上，然后 用3％小牛血清封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育2小时后ECL发光，曝 光胶片后，测定灰度值 6、FACS分选侧群细胞 37C预热的DMEM培养液(含2％FBS和lOmmol／1HEPES缓冲液)重悬，计 1 2 细胞；紫外光源流式细胞仪进行检测及分选。 7、Transwell基质胶细胞侵袭试验 作为趋化诱导剂，孵箱中孵育36小时后取出，用无菌的棉签擦拭去上室的胶，滤 膜经固定、染色后封片，镜检10个高倍视野(400x)。 8、克隆形成能力实验 将刚刚分选所得的SP和non．SP细胞分别接种于六孔扳，培养一周左右进行 结晶紫染色计数形成的克隆数(见图)。克隆形成率(CloneFormationEfficiency，CFE)