ape1基因沉对人肝癌mhcc97-h体内成瘤能力及ap-1信号通路的影响.pdf

APE1 基因沉默对人肝癌 MHCC97-H 体内成瘤能力及 AP-1 信号通路的影响 摘 要 目的 观察 APE1 基因表达沉默后对人高侵袭肝癌细胞株 MHCC97-H 在裸鼠体 内成瘤能力的影响，及其在AP-1 信号通路的作用，为进一步阐明肝细胞癌增殖 及侵袭转移的分子机制提供实验依据。 方法 培养人高侵袭肝癌细胞株 MHCC97-H ，使用慢病毒载体介导的 siRNA 技 术，用构建的 LV-APE1-shRNA （实验组）表达载体感染MHCC97-H 细胞，并设 LV-APE1-NC （空载体）组和 control （空白对照）组，随后将3 组细胞分别接种 于裸鼠皮下，第 21d 处死裸鼠，剥瘤称重，计算抑瘤率，绘制肿瘤生长曲线。制 作移植瘤组织 HE 切片，观察肿瘤细胞形态。采用 RT-PCR 及 Western blot 方法 分别检测各组裸鼠移植瘤组织中 APE1 及其下游 AP-1 信号通路相关基因 c-Fos、 c-Jun、caspase-3 和 MMP-2 的 mRNA 及蛋白表达水平。采用 TUNEL 法检测各 组肝癌细胞的凋亡情况，计算凋亡指数。 结果 1．LV-APE1-shRNA 组裸鼠移植瘤生长缓慢，肿瘤体积（0.467±0.052 ）cm3 及质 量（0.267±0.082 ）g 均小于 LV-APE1-NC 组（1.700±0.063）cm3 、（1.018±0.160） g 和 control 组（1.780±0.095）cm3 、（1.107±0.178）g，差异有统计学意义(P0.01) ； LV-APE1-shRNA 组肿瘤抑制率为 73.772%。 2. HE 染色镜下形态显示，LV-APE1-shRNA 组肿瘤组织坏死少见，较多肿瘤细胞 凋亡小体，病理性核分裂5 个/HPF 。LV-APE1-NC 组和 control 组肿瘤组织坏死 明显，可见散在肿瘤细胞凋亡小体，病理性核分裂5 个/HPF 。 3 ．RT-PCR 结果显示，LV-APE1-shRNA 组 APE1 、c-Fos、c-Jun、caspase-3 及 MMP-2 的 mRNA 表达水平明显低于 LV-APE1-NC 组和 control 组，差异有统计 学意义(P0.01) 。APE1 基因沉默后可下调 90.622%APE1 、47.580%c-Fos 、 47.402%c-Jun、65.355%caspase-3、64.369%MMP-2 的 mRNA 表达，APE1 与c-Fos、 c-Jun、caspase-3、MMP-2 mRNA 的表达呈正相关性。 4 4.Western blot 结果显示，LV-APE1-shRNA 组 APE1 、c-Fos、c-Jun、caspase-3 及 MMP-2 的蛋白表达水平明显低于LV-APE1-NC 组和 control 组，差异有统计学意 义 (P0.01) 。APE1 基 因 沉 默 后 可 下 调 72.439%APE1 、 71.872%c-Fos 、 80.399%c-Jun、75.616%caspase-3、88.393%MMP-2 的蛋白表达，APE1 与 c-Fos、 c-Jun、caspase-3、MMP-2 蛋白的表达呈正相关性。 5 ．TUNEL 法凋亡检测实验发现，LV-APE1-shRNA 组肿瘤组织凋亡细胞数明显 高于 LV-APE1-NC 组和 control 组，差异有统计学意义（P0.01 ）。LV-APE1-shRNA 组肿瘤细胞凋亡指数为 5.503 ％，LV-APE1-NC 组为 2.911 ％，control 组为 2.569 ％。 结论 1.成功构建人高侵袭肝癌细胞株 MHCC97-H 裸鼠移植瘤动物模型，慢病毒载体 介导的 APE1 基因沉默可显著抑制 MHCC97-H 细胞株在裸鼠体内的生长。 2. RT-PCR 及 Western blot 实验表明，APE1 、c-Fos、c-Jun、caspase-3 和 MMP-2 基因在移植瘤组织中的 mRNA 及蛋白表达明显受到抑制，APE1 对 c-Fos、c-Jun、 caspase-3、MMP-2 的表达具有正向调控作用。APE1 可通过调控 AP-1