不可分型流感嗜杆菌p6蛋白的原核表达及其免疫原性分析.pdfVIP

IIIIllllIlUIIIIIIIIlllllIIIllIllIIJ 目 录 Y2397894 中文摘要…………………………………………………………………1 英文摘要…………………………………………………………………3 研究论文 不可分型流感嗜血杆菌P6蛋白的原核表达及其免疫原性分析 前言………………………………………………………………………………………．6月!J舌………………………………………………………………………………………‘6 材料与方法…………………………………………………………7 结果………………………………………………………………………………………·17 附图…………………………………………………………………22 讨论………………………………………………………………………………………·29 结论………………………………………………………………………………………·31 1 参考文献……………………………………………………………3 综述流感嗜血杆菌耐药性的研究进展………………………………·35 个人简历…………………………………………………………………43 中文摘要 不可分型流感嗜血杆菌P6蛋白的原核表达 及其免疫原性分析 摘 要 目的：不可分型流感嗜血杆菌(NontypeableHaemophilusinfluenzae NTHi)是一类没有荚膜的革兰阴性杆菌，常寄居于人类上呼吸道，存在 于多达80％健康儿童和40％健康成人的咽部，作为条件致病菌，常导致呼 吸道反复感染及引发中耳炎和鼻窦炎等疾病，成为目前儿童细菌性感染的 主要病原体之一，因此，开发研制预防NTHi感染的安全有效疫苗显得尤 为重要。由于NTHi没有荚膜多糖，所以挑选具有良好免疫原性的蛋白抗 原已成为研究NTHi疫苗的焦点。研究表明，在所有流感嗜血杆菌菌株中 (包括可分型和不可分型流感嗜血杆菌)高度保守的外膜蛋白P6(outer membrane proteinP6，P6)可以诱导机体产生保护性的体液免疫、细胞免疫， 但菌体内P6蛋白含量很低并且提取过程复杂，限制了对其进一步的研究。 本研究的目的是：通过基因工程技术构建外膜蛋白P6原核表达载体，获 得重组外膜蛋白P6，经腹腔注射和滴鼻途径免疫小鼠，评价重组P6蛋白 的免疫原性，以确定重组P6蛋白在NTHi疫苗研制中的应用价值。 方法：以NTHi全基因组为模板通过PCR扩增获得P6目的基因，将 落PCR、酶切分析、基因测序的方法对重组质粒进行鉴定；将重组质粒 转化入E．coli 表达，利用表达的融合蛋白带有的GST(glutathione 析确认；将纯化的GST-P6蛋白经腹腔注射或滴鼻两种方式免疫7．-一，8周 龄BALB／c小鼠，分别于第0天、14天、28天对小鼠进行三次免疫，末 次免疫后14天，取小鼠血、脾和肺灌洗液标本，Western blotting检测血 清P6蛋白抗体特异性，间接ELISA法检测血清及肺洗液中抗体IgG和 产生水平。 中文摘要 I和 Not I双酶切分析、以及DNA序列测定，均证实插入的基因片段为P6蛋 白基因；重组质粒PGEX．6P2／P6成功转入E．cofiXL．Blue，P6蛋白得到大 特异性条带，表明纯化得到了目的蛋白P6；免疫动物后采集标本检测， 间接ELISA结果表明重组P6蛋白通过滴鼻和腹腔注射均能刺激小鼠产生 IgG，与腹腔注射相比，滴鼻途径能诱导肺粘膜产生较高的特异性IgA抗 体。WB结果显示重组蛋白组小鼠血清稀释800倍后仍有特异性目的条带