SRY基因在性别鉴定中的应用解读.pptVIP

* 遗传学实验 SRY基因检测及在性别鉴定中的应用 * 二、实验目的 了解SRY基因检测及在性别鉴定中的应用 * 二、实验原理 性别的发育起始于胚胎第6周， 胚胎的初期是属于中性的。 所有的早期胚胎內都存在着两种性腺，外胚胎内存在两套导管， 发育成女性的前身苗氏管（Müllerian ducts） 发育成男性的前身沃氏管（Wolffian ducts） * SRY基因（sex-related Y） SRY基因（sex-related Y）是人类性别决定基因，定位于Yp11.3. 只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。 该蛋白的功能是与DNA结合激活抗中肾旁管物质（MIS苗氏管抑制物质）调节途径，导致MIS表达，使前身苗氏管退化，女性生殖系统不能生成，生成睾酮，通过双氢睾酮作用，使胚胎体內的男性的前身沃氏管（Wolffian ducts）发育，生成男性生殖系统。 * PCR技术原理 PCR技术是一种体外核酸扩增系统，根据SRY的序列，合成特异引物，经PCR扩增仪的变性、退火和延伸三个步骤的多次循环，形成与模板链互补的新DNA链，产物长度300bp左右。 * Yp11.3 * 基因组DNA的提取 磁珠法提取DNA 碱裂解法提取DNA 1.用NaOH作用20分钟 2.加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。 1.裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶 2.基因组DNA选择性吸附于磁珠 3.通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，去除细胞代谢物、蛋白等杂质 4.用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱 磁珠法提取DNA试剂盒 磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。 快速简捷，一般可在36分钟内完成。 · 不用多次漂洗磁珠也可确保高纯度，提取出的基因组DNA OD260/OD280典型的比值达1.7-1.9， 长度可达2 0 k b - 5 0 k b，可直接用于P C R、Southern-blot和各种酶切反应。 * 新鲜植物、动物组织，高温干燥过 DNA破坏比较严重的植物、动物组织，海洋生物，法医鉴定，新鲜哺乳动物血液或干血点，转基因食品 * 1.样品处理 a.3根含毛囊的毛发 向1.5ml离心管加入380μl Buffer MGL和20μl Proteinase K，从毛发根部取1cm长的含毛囊的毛发加入上述离心管中。 b.口腔脱落的细胞 2ml唾液或10ml漱口水，2000rpm离心5min,将上清用移液器小心移去，向沉淀加入380μl Buffer MGL和20μl Proteinase K。 * 2.将上述离心管振荡混匀，65 ℃水浴20min，间或混匀，使样品充分裂解。 3.向充分裂解的样品加入400μl Buffer MA和10μl Magicmag beads,振荡混匀10s. 吸取Magicmag beads之前，先混匀。务必将Magicmag beads加至液面以下） 4.将离心管置于磁力架上，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。 吸弃上清时，不要吸入Magicmag beads） * 5.加入700μl70 %乙醇，振荡混匀10s.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。 6.重复步骤5，室温开盖干燥15min至管内无残液。 7.加入15-25μl TE Buffer, 65 ℃水浴20min，间或混匀,离心2min， 8.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmag beads完全吸至管壁上之后，吸取上清至新的离心管，即获得jiyinzuDNA. * 磁珠法提取DNA * * * 基因组DNA的提取 碱裂解法提取DNA 1.用NaOH作用20分钟 2.加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。 1、毛发样品DNA的制备 （1）男生毛发10根，女生毛发10根作为对照。 也可取一些口腔上皮细胞。 （2）在一个200ul PCR管中加20μl的0.2mol/L NaOH溶液。剪下带毛囊的发根部分，放入管中并盖上管盖，放入有热盖的PCR仪中， 75℃温育30min，以避免水分蒸发。 如使用牙签刮取口腔上皮细胞，应注意沾过NaOH溶液的牙签不能再放回口腔，以免烧伤。 （3）加入50μl的0.04 mol/L HCl中和。 （4）12000 r/min 离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶液中。 2、PCR反应 （1）扩增人的SRY基因，所用引物为： SRY1: 5’-TGG GAC TGG TGA CAA TTG TC-3 SRY2