小鼠趋化因子mp-1α和共刺激分子b7-1基因重组慢病毒载体的构建及鉴定.pdf

小鼠趋化因子MIP-1 α和共刺激分子B7-1 基因重组慢 病毒载体的构建及鉴定 中文摘要 【目的】 肿瘤基因治疗的关键是载体的选择，慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒 （HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂期细胞和非分裂期细胞均具 有感染能力，能够整合到宿主细胞的基因组中，可以在体内长期稳定表达，还具 有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点。本研究采用慢病毒作为载体， 构建小鼠趋化因子MIP-1 α和共刺激分子B7-1 基因重组慢病毒载体，鉴定其在 293T 细胞中的表达，为双基因治疗淋巴瘤的实验研究奠定基础。 【方法】 1. 第一部分，自行设计引物合成小鼠MIP-1 α和B7-1 基因的全长编码序列cDNA, 采用巢式PCR 扩增目的基因，使用Age I 酶对慢病毒载体进行酶切消化，将 目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接，其产物转化大肠杆菌 DH5 α感受态细胞，对长出的阳性克隆进行PCR 鉴定和直接测序序列分析，测 序结果与目标基因序列完全一致的即为构建成功的目的基因质粒。然后将构 建好的目的基因质粒进行超纯去内毒素抽提。 2. 第二部分，MIP-1 α和B7-1 目的基因质粒分别转染293T 细胞，48 小时后， 观察荧光报告基因的绿色荧光蛋白（GFP）表达，并采用Western Blot 法检 测目的基因质粒在293T 细胞中的表达。 3. 第三部分，采用 pGC-LV 重组慢病毒载体和包装质粒 pHelper 1.0 载体、 pHelper 2.0 载体组成的三质粒系统，共转染293T 细胞，培养48 h 后，收 集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩和纯化得到高滴度的慢病毒浓缩 液。取10 µl 慢病毒浓缩液转染293T 细胞，提取总RNA，逆转录获得cDNA， 应用实时荧光定量PCR 检测慢病毒浓缩液的滴度。 【结果】 1. 成功构建小鼠趋化因子MIP-1 α和共刺激分子B7-1 基因重组慢病毒载体， 3 目的基因测序结果与目标序列完全一致。 2. MIP-1 α和B7-1 目的基因质粒转染293T 细胞后，均可观察到荧光报告基 因的绿色荧光蛋白表达，Western Blot 法成功检测到 MIP-1 α、B7-1 目的基 因质粒在293T 细胞中表达。 3. 三质粒系统成功共转染 293T 细胞，包装出高滴度的MIP-1 α、B7-1 基因 重组慢病毒浓缩液，实时荧光定量 PCR 证实 MIP-1 α、B7-1 基因重组慢病毒 载体的滴度均达2.00E+8 TU/ml。 【结论】 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠趋化因子 MIP-1 α和共刺激分子 B7-1 基因重组慢病毒载体，为淋巴瘤双基因治疗的实验研究奠定了基础。 【关键词】 慢病毒载体 293T 细胞 MIP-1 α基因 B7-1 基因 实时荧光定量PCR 淋巴瘤 4 Constructing and Identification of Lentivirus -mediated Mouse MIP-1α and B7-1 Gene Vectors ABSTRACT 【AIM 】 The choice of vector is key step for cancer gene therapy. Lentivirus vector reconstructed from human immunodeficiency virus (HIV), not only can infect mitotic phase cells and metabolic stage cells, but also is able to integrate into the host cell genome and get a long-term stable expression. Inaddition, Lentivirus vector could accommodate large-scale exogenous target gene segments and sho