第10章外源基因表达与基因工程药物摘要.ppt

外源基因表达与基因工程药物 第 一 节概述 基因工程（genetic engineering) 为实现基因克隆所采用的方法和相关技术，包括重组DNA技术及操作过程，表达产物的后续处理过程和技术（如蛋白质分离纯化、修饰和加工技术、中试和扩大生产规模的工艺和技术等）统称为基因工程。 第 二 节外源基因表达基本过程 一、目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 RT-PCR扩增，从总RNA或mRNA反转录扩增 PCR扩增从 cDNA文库(cDNA library) 或基因组文库(genomic DNA library)扩增 杂交技术从cDNA文库或基因组文库筛选 利用筛淘技术，从各类型文库中筛淘 本身是复制子，能自主复制； 分子量小，易于操作和易于得到完整分子 具有选择性标记，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 有一定的非必要区（即插入外源DNA不影响其复制的区段。 需要的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 如：细菌感受态制备、重组体转化及筛选 原核生物mRNA作为模板进行翻译的效率与强度与SD序列的碱基排序和组成以及其与起始密码子ATG的间隔相关： 在各种mRNA起始AUG上游约8～13核苷酸部位，存在一段由4～9个核苷酸组成的一致序列，富含嘌呤碱基，如-AGGAGG-，称为Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又称核蛋白体结合位点(ribosomal binding site, RBS)。一条多顺反子mRNA序列上的每个基因编码序列均拥有各自的S-D序列和起始AUG。 mRNA序列上紧接S-D序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别并结合。 新生多肽链不具备蛋白质的生物学活性，必须经过复杂的加工过程才能转变为具有天然构象的功能蛋白质，这一加工过程称为翻译后修饰(posttranslational modification)。 翻译后修饰包括多肽链折叠为天然的三维构象及对肽链一级结构的修饰、空间结构的修饰等。翻译后修饰使得蛋白质组成更加多样化，从而使蛋白质结构上呈现更大的复杂性。 多肽链折叠为天然构象的蛋白质 新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N-端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。 一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。 细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶和蛋白质辅助。 第 三 节原核细胞表达系统 第 四 节真核细胞表达系统 第 五 节重组基因工程药物 重组药物产品开发 基因工程药物 利用基因工程技术克隆并表达的一类蛋白质与多肽类药物，如控制糖尿病的重组人胰岛素、治疗血友病的重组人凝血因子Ⅷ、溶栓治疗用的重组人尿激酶等。 基因工程疫苗 利用基因工程技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体本身制成的疫苗。 基因工程抗体 （一）乳糖操纵子(lac operon)的结构 调控区 CAP结合位点 启动序列 操纵序列 结构基因 Z： β-半乳糖苷酶 Y： 透酶 A：乙酰基转移酶 Z Y A O P DNA mRNA 阻遏蛋白 I DNA Z Y A O P pol 没有乳糖存在时 阻遏基因 阻遏蛋白的负性调节 mRNA 阻遏蛋白 有乳糖存在时 I DNA Z Y A O P pol 启动转录 mRNA 乳糖 半乳糖 β-半乳糖苷酶 图13-4 lac 操纵子与阻遏蛋白的负性调节 S-D序列 小亚基中的16S-rRNA 3ˊ-端有一富含嘧啶碱基的短序列，如-UCCUCC-，通过与S-D序列碱基互补而使mRNA与小亚基结合。 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞） 真核基因顺式作用元件影响基因转录活性 启动子 真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。 TATA盒 GC盒 CAAT盒 CCAAT盒 GC盒 TATA盒 转录起始点 高等真