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Cu1lin一5表达下调对足细胞形态及增殖功能 的初步影响 浙江大学医学院 儿科学 硕士研究生 曹璐 导 师 毛建华 中文摘要 【研究背景l 肾小球性蛋白尿发生的根本原因是由于肾小球滤过屏障受损，而 肾小球上皮细胞则是保持肾小球滤过膜功能完整的关键因素。近十余 年来的众多研究发现，很多先天性肾病综合征患者的发病是由于 Neph 及肾小球上皮细胞足突融合等病变，表明这些表达在肾小球上皮细胞 的足突分子(如Neph 肾小球滤过膜完整性、阻止血浆蛋白漏出起着重要作用。 本研究小组近年来的研究也发现，Nep 足突分子的表达及调控变化确实与部分中国原发性肾病综合征患儿的 e(一种肌球蛋白I类分子) 发病密切相关。同时我们还证实，My01 n 也是人、小鼠肾小球上皮细胞的骨架相关蛋白，其表达Knock．down 后斑马鱼可出现蛋白尿及肾小球上皮细胞结构变化。 所有细胞的蛋白质都需要代谢和更新，真核细胞内蛋白质的调节 和降解主要有两个途径：溶酶体途径和泛素一蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome 酶E1s、泛素交联酶E2s、泛素连接酶E3s等组成，是高效、特异的 蛋白质降解系统，是细胞调控特定蛋白质、去除错误折叠蛋白的主要 机制。泛素连接酶E3s的主要作用是识别特定的需要被降解的靶蛋白， 并把泛素转移到靶蛋白上，最后通过蛋白酶降解靶蛋白。CulI．n．5 解。其编码基因(位于11q22．23)序列与精氨酸加压素激活钙转运受 体．1(、／ACM．1)高度同源，所以这两者可能是同一种蛋白。迄今为止， 参与真核细胞胞内众多蛋白质的泛素化修饰及特异性降解；2、作为主 要表达在血管内皮细胞的蛋白质，VACM．1在多个细胞株都表达出抑 制细胞增殖的活性，具抗肿瘤效应。 我们的前期研究表明，CUL5在人、小鼠肾小球上皮细胞有表达， 其表达下调可导致模式动物斑马鱼出现蛋白尿。我们分析，CUL5表达 下调可导致蛋白尿的机制可能与由此导致的以CUL5为基石的UPS功 能异常，并最终引起足突分子及细胞骨架相关蛋白的代谢、 转换和更 新机制失调有关． 【目的】 研究CUL5敲低之后，小鼠的肾小球足细胞的形态和增殖的变化。 m 阐明CUL5在维持足突分子和肾小球滤过屏障的功能中可能发挥的关 键作用。 【方法】 1．小鼠肾小球足细胞培养。 2．细胞免疫荧光法鉴定足细胞及细胞骨架蛋白。 个阴性对照质粒。由InvitrOgen公司合成。 染，敲低CUL5表达。 4．0软件，分析凝 GAPDH作为内参基因，经过Geo-pIo—AnalyZer 胶电泳后图片，半定量分析基因表达差异。 J软件分析，半定量分析蛋白表达的差 作为内参基因，经过Image 异。 7．细胞免疫荧光法检测CUL5敲低之后足细胞形态学的变化。 8．细胞免疫荧光法检测CUL5敲低之后细胞骨架蛋白的变化。 9．MTT法检测各个实验组细胞的增殖情况，分别设定4个实验点，即 24小时、48小时、72小时、96小时，检测细胞的OD值。 【结果】 cond．1ion)下，增殖状 1．小鼠足细胞，在33℃允许条件(permissive 态下的足细胞呈“鹅卵石样． 胞核呈圆形，位于胞体中央，足突 较少较短；在转入37℃非允许条件(non-permissiveconditjon)下， Ⅳ 培养约14天的时间，足细胞分化成熟，胞质向四周伸展，形状不 规