cαq蛋白对c4+t淋巴细胞稳态增殖作用的调控及机制研究.pdfVIP

Gaq蛋白对CD4+T淋巴细胞稳态增殖作用的调控及机制究． 摘要 a 目的：1．明确Gq蛋白对CD4+T细胞稳态增殖的调控。2．阐明G flq蛋白调控CD4+T细胞稳态增殖的机制。方法：1．建立骨髓嵌合鼠。 同龄同性别Ga C57BL／6小鼠进行脱颈处死， q基因敲除小鼠和wild 取其双下肢完整的股骨和胫骨，置于70％酒精中浸泡3分钟，用无菌 的PBS洗3次，转移至无菌的培养皿中，用lml注射器将骨髓吹出。 然后应用红细胞裂解液去除红细胞，进行骨髓单个核细胞计数。分别 取出4x106个细胞静脉注射到1000 cGy致死剂量辐照的同龄同性别 wild C57BL／6小鼠中进行骨髓移植，建立骨髓嵌合鼠，继续在SPF 环境下饲养2个月，取脾脏进行实验。2．分离、纯化CD4+T细胞。同 龄同性别G仪q基因敲除小鼠和wildC57BL／6小鼠或同批次的骨髓嵌 合鼠的脾脏，经研磨、过滤制成单细胞悬液，应用红细胞裂解液去除 红细胞。采用磁珠阳选的方法分离CD4+T细胞。首先将脾脏单个核细 胞与生物素标记的anti—CD4在冰上孵育30分钟，离心去除未结合的 抗体后，加入亲和素包被的磁珠，冰上孵育30分钟后，应用Mini-MACS 分选系统分别纯化CD4+T细胞。纯化的细胞在进行研究前，应用流式 细胞术进行纯度鉴定，未达到95％时可用新的分选柱进行再次纯化。 3．检测CD4+T细胞稳态增殖及其影响因素。应用上述分选方法分选 G仪q基因敲除小鼠和wildC57BL／6小鼠的CD4+T细胞。在体外进行 CFSE标记后，以每只小鼠分别给予静脉注射4x106个细胞的剂量，静 万方数据 脉注射给同龄同性别300cGy亚致死剂量辐照的wildC57BL／6小鼠， 在不同时间点，取其脾脏进行检测，应用流式细胞术根据CFSE荧光 强度检测细胞的稳态增殖。实验设计如下：取8-12周龄同性别 C57BL／6小鼠20只，分成2组，每组10只，均给予300cGy亚致死 剂量辐照。第一组每只静脉注射4x106 CFSE标记的Gczq基因敲除小 鼠脾脏CD4+T细胞；第二组每只静脉注射4x106CFSE标记的wild小 鼠脾脏CD4+T细胞；注射后的第2、5天每组取5只小鼠取其脾脏细 胞，应用流式细胞术分析CFSE阳性细胞的增殖，并分别进行比较稳 态增殖的差异。纯化的CD4+细胞T细胞在进行稳态增殖前及稳态增殖 的第2、5天用流式细胞术进行BTLA、CD62L表面标记的检测，并比 较表达的差异。结果：1．稳态增殖前，通过流式细胞仪检测比较，野 生型与Ga 无明显差异(PO．05)。2．CFSE染色后，通过流式细胞仪的检测比 a 较，2天组中野生型组与Gq缺失组型小鼠CD4+T细胞增殖无统计学 a 意义(P0．05)。5天组G q缺失组型小鼠CD4+T细胞比野生组型 a 较，2天组中Gq基因敲除组小鼠和野生型小鼠中CFSE标记的CD4+T 表达明显高于Ga aq基因 q基因敲除组小鼠(PO．01)。5天组G a 低于5天组野生型小鼠组(PO．01)。结论：1．Gq蛋白促使CD4+T a 细胞进行更多更快的稳态增殖。2．Gq蛋白可通过BTLA、CD62L的 万方数据 表达来调